BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 POS VIR 017 INT rev. 1 del 19/06/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR LECTINA

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1 BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo

2 BIOTECNOLOGIE pag 2 di Scopo Lo scopo della presente procedura è quello di descrivere le responsabilità e le modalità operative per la rilevazione di soia (Glycine max) in matrici agro-alimentari mediante metodiche di PCR real time. 2. Campo di applicazione La presente procedura viene applicata a DNA estratto da matrici contenenti, costituite o derivate da soia per la rilevazione di Glycine max e la valutazione quali-quantitativa del DNA estratto. Nel caso in cui il DNA di soia venga rimosso o altamente degradato durante il processo produttivo della matrice agro-alimentare, il metodo non fornisce risultati affidabili. 3. Definizioni ed abbreviazioni - bp (base pairs): coppie di basi - Controllo LOD: DNA estratto da un materiale di riferimento a base di soia utilizzato ad un quantitativo corrispondente al LOD (limite di rilevazione) - Ct o ciclo soglia: ciclo al di sopra del quale la fluorescenza misurata supera un valore soglia e si distingue dal rumore di fondo. - DNA bersaglio endogeno: tratto di DNA caratteristico della specie vegetale analizzata, presente in un numero di copie costante e conservato nelle diverse varietà vegetali di quella specie. - LOD (limit of detection): limite di rivelazione - NTC (no template control): controllo negativo di PCR - OGM (Organismi Geneticamente Modificati): organismi il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura con l accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale. - PCR (Polymerase Chain Reaction): reazione enzimatica in vitro, catalizzata da DNA polimerasi DNA dipendenti, che determina l amplificazione del DNA bersaglio. - Primer: oligonucleotide, che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio, utilizzato per innescare la reazione di PCR. - Probe o sonda: oligonucleotide marcato che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio rivelandone la presenza. - Real Time PCR: tipologia di PCR in cui il sistema di rilevazione, avvalendosi di sonde marcate con fluorocromi specifiche per il prodotto di amplificazione, consente di seguire ciclo dopo ciclo l andamento della reazione. 4. Riferimenti - ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database User Guide - Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and SDS Enterprise Database User Guide

3 BIOTECNOLOGIE pag 3 di 11 - Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing - European Network of GMO Laboratories (ENGL) Version (http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/doc/min_perf_requir_analyt_methods_ pdf) - DO VIR Documento Organizzativo - UNI EN ISO 21570: 2006 Prodotti alimentari - Metodi di Analisi per la ricerca di organismi geneticamente modificati e di prodotti derivati - Metodi quantitativi basati sull'analisi dell'acido nucleico (Annex C, paragrafo C.1.7) - IGR VIR 001 Istruzione gestione reagenti - IL VIR 002 Creazione di file TEMPLATE.sdt - UNI EN ISO :2006 Prodotti alimentari - Metodi di Analisi per la ricerca di organismi geneticamente modificati e di prodotti derivati - Requisiti generali e definizioni - PG QUA 011 Validazione dei metodi e stima dell incertezza di misura - PG QUA 005 Gestione dei documenti - PG VIR 001 Ricevimento, analisi, conservazione e smaltimento di campioni ufficiali prelevati per la ricerca di organismi geneticamente modificati (OGM) - PG VIR 003 Gestione delle aree e delle attività per l esecuzione dei protocolli di PCR - POS VIR 015 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB precipitante - POS VIR 016 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Maxi Kit - POS VIR 052 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB - POS VIR 053 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Mini Kit - The fitness for purpose of analytical methods, EURACHEM Guide, Moduli allegati - POS VIR 017 INT/1 Organismi Geneticamente Modificati (OGM): MONITOR PCR LECTINA - Foglio di lavoro 6. Principio Il DNA estratto e purificato dal campione da sottoporre a prova è amplificato enzimaticamente e rilevato mediante l impiego di una coppia di primer ed una sonda specifici per il DNA bersaglio endogeno (regione del gene lectina) caratteristico della soia (Glycine max): Nome Tipo Sequenza 5-3 Lectin F Fw TCC ACC CCC ATC CAC ATT T Lectin R Rv GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA Lectin probe Pr FAM- AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA L amplificazione del DNA bersaglio endogeno genera un amplificato di 81 bp. L eventuale comparsa di amplificati viene seguita attraverso un sistema di rivelazione in fluorescenza integrato allo stesso apparato di amplificazione. Vengono utilizzate sonde marcate con due fluorocromi, cosiddetti reporter (legato al 5 della sonda) e quencher (legato al 3 ); in assenza di amplificazione, il reporter irradiato trasferisce energia al quencher e viene osservata la fluorescenza solo di quest ultimo; a seguito di amplificazione, l attività 5 esonucleasica della polimerasi rimuove il reporter dalla sonda con conseguente emissione di fluorescenza specifica del reporter. Tale fluorescenza aumenta in modo direttamente

4 BIOTECNOLOGIE pag 4 di 11 proporzionale al numero di amplificati. La fluorescenza misurata viene normalizzata rispetto ad un fluorocromo di riferimento passivo (ROX) presente nella miscela di reazione. La monitor run viene effettuata come prova qualitativa per tutti i DNA estratti da campioni, controlli e materiali di riferimento contenenti, o che possono contenere Glycine max. Questi vengono analizzati solo con il sistema endogeno lectina, allo scopo di determinare la rilevabilità di DNA di soia nell estratto. Nella monitor run ciascun campione, controllo e/o materiale di riferimento viene sottoposto a prova ad almeno due concentrazioni diverse di DNA, ciascuna esaminata in duplicato. La differenza tra i Ct medi osservati ( Ct) deve corrispondere all appropriato fattore di diluizione del DNA in modo da verificare l eventuale presenza di inibitori di PCR. Nella reazione è inserito un campione di DNA di soia alla concentrazione del LOD del metodo (controllo LOD), il cui valore di Ct rappresenta il cut off oltre il quale i campioni vengono considerati negativi per la presenza di DNA di soia. 7. Apparecchiature, materiali, reagenti, materiali di riferimento e dispositivi di protezione individuale 7.1 Apparecchiature ABI Prism 7900HT Sequence Detection System ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Cappa a flusso laminare verticale sterile Congelatore -20 C +/- 5 Frigorifero +4 C +/- 2 Microcentrifuga Pipette monocanale volumi da 2 a 1000 µl Produttore di ghiaccio Vortex 7.2 Materiali Bicchieri di plastica Forbici Ghiaccio Griglia per microprovette Micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp Pinzette Provette tipo Eppendorf da 1,5 ml Provette tipo Eppendorf da 2,0 ml Puntali con filtro volumi da 2 a 1000 µl Secchielli per ghiaccio Soluzione decontaminante (IPR VIR 081) Soluzione disinfettante etanolo al 70% (IPR VIR 050) Strumento per l installazione dei tappi MicroAmp o pettine per il fissaggio della pellicola adesiva Supporti speciali per provette da 1,5 ml Supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti o per microprovette

5 BIOTECNOLOGIE pag 5 di 11 Tappi ottici MicroAmp o pellicola ottica adesiva 7.3 Reagenti H 2 O grado reagente sterile (IPR VIR 096) Master Mix PCR LECTINA (IPR VIR 125) TE: Tris-HCl ph 8,00 1mM / EDTA ph 8,00 0,01 mm (IPR VIR 127) 7.4 Materiali di riferimento DNA estratto da materiali di riferimento certificati a base di farina di soia. 7.5 Dispositivi di protezione individuale Guanti in lattice o vinile senza polvere Camice 8. Responsabilità Il Responsabile di Struttura ed il Responsabile della Prova hanno la responsabilità di garantire e verificare la corretta applicazione della presente procedura. Le responsabilità relative alla preparazione dei reagenti, all esecuzione del metodo di prova, alla lettura ed alla verifica dei risultati sono riportate sui moduli PG SQA 005/12: Tabella responsabilità personale a tempo indeterminato (TRPI) e PG SQA 005/13: Tabella responsabilità personale a tempo determinato, collaboratori e consulenti (TRPD). 9. Modalità operative 9.1 Norme di igiene e sicurezza Per l esecuzione della presente procedura si rimanda a quanto disposto dalla PG VIR 003 specificando che tali disposizioni, vista l innocuità della prova per l operatore, sono esclusivamente a tutela dell esito della prova stessa. 9.2 Preparazione dei campioni e dei controlli Da eseguire nell area di prova 202 o 221A sotto cappa a flusso laminare verticale sterile. Nell eseguire la procedura compilare modulo POS VIR 017 INT/1. Come controlli negativi usare il controllo negativo estrazione e il controllo negativo PCR (H 2 O a grado reagente sterile) Come controllo positivo usare il controllo positivo di estrazione. Per la determinazione del Ct cut off al di sopra del quale i campioni sono da considerarsi negativi, introdurre anche un DNA di controllo positivo ad un quantitativo corrispondente al LOD (controllo LOD).

6 BIOTECNOLOGIE pag 6 di 11 Dai campioni/controlli, estrarre e purificare il DNA secondo una delle seguenti procedure di supporto: POS VIR 052 SUP, POS VIR 053 SUP, POS VIR 015 SUP oppure POS VIR 016 SUP. Se possibile, quantificare il DNA ottenuto mediante lettura spettrofotometrica. Per i campioni ed il controllo positivo diluire il DNA estratto nel modo seguente: 1. nel caso in cui la resa di DNA estratto sia inferiore o uguale a 40 ng/µl, diluire 1:4, con H 2 O grado reagente sterile o buffer TE. Nella monitor run vengono esaminate la concentrazione del DNA estratto tal quale e la diluizione 1:4. 2. nel caso in cui la resa sia superiore a 40 ng/µl, diluire il DNA, con H 2 O grado reagente sterile o TE, alle concentrazioni di 40 ng/µl e 10 ng/µl, che saranno entrambe esaminate nella monitor run. Conservare a + 4 C ± 2 (al massimo per una settimana) oppure in congelatore a 20 C ± 5, per periodi più lunghi. Ciascuna diluizione dei campioni e del controllo positivo di estrazione viene sottoposta a prova in duplicato. Il controllo negativo di estrazione è analizzato in duplicato senza sottoporlo a diluizione. Il controllo negativo di reazione (NTC) e il controllo LOD vengono esaminati anch essi in duplicato. 9.3 Allestimento della prova Durante l esecuzione della prova quantitativa, compilare le seguenti pagine del foglio di lavoro POS VIR 017 INT/1contenuto nel file excel POS VIR 017 INT monitor lectina : pag.1- elenco campioni e controlli pag.2- allestimento piastra pag.3- esiti Prima fase Accensione ed impostazione dell amplificatore 1. Accendere l ABI Prism 7900HT Sequence Detection System o l ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System almeno 30 prima della prova per far scaldare il laser all interno dello strumento. 2. Aprire il file TEMPLATE monitor lectina.sdt, predisposto con il seguente profilo di amplificazione: Step Stage T ( C) Tempo (sec.) Acquisizione 1 Attivazione UNG (Uracil-Nglicosilasi) 2 Denaturazione e attivazione della polimerasi 3a Denaturazione 95 C 15 NO 3b Annealing e sintesi 60 C 60 SI n. cicli 50 C 120 NO 1x 95 C 600 NO 1x 50x

7 BIOTECNOLOGIE pag 7 di 11 Per l impostazione del file vedi l istruzione IL VIR Definire quindi la collocazione dei controlli e dei campioni nella piastra di reazione da 96 pozzetti in cui avverranno le reazioni riportandola a pag.2 del modulo POS VIR 017 INT/1. 4. Salvare il file come GG-MM-AA monitor lectina.sds, indicando il giorno-mese-anno nel nome del file. Nel caso vengano effettuate più corse nella stessa giornata, attribuire ai file una numerazione sequenziale (es. GG-MM-AA monitor lectina1.sds, GG-MM- AA monitor lectina2.sds, ecc.) Seconda fase Preparazione della miscela di reazione Compilare la pagina 1 del file excel POS VIR 017 INT monitor lectina inserendo nella cella corrispondente il numero dei campioni/controlli da sottoporre a prova. Nella cella Volume di Master Mix da prelevare (ul): dello stesso file, è presente la formula per il calcolo automatico del volume di Master mix da prelevare con una correzione +15% (ad esempio, per ogni campione da analizzare in duplicato, prelevare 46 µl di master mix). Nell area di prova 205 sotto cappa a flusso laminare verticale sterile prelevare il volume di master mix calcolato (MASTER MIX PCR LECTINA, IPR VIR 125). Prelevare una aliquota di acqua grado reagente sterile di almeno 15 µl da utilizzare come NTC. Trasferire le provette contenenti la master mix e l NTC nell area di prova 202 o 221A. Terza fase Allestimento della prova Sotto cappa a flusso laminare verticale sterile nell area di prova 202 o 221A predisporre il seguente materiale: - Supporti speciali per provette da 1,5 ml. - Provette da 1,5 ml autoclavate. - Due bicchieri di plastica inseriti uno nell altro e contenenti qualche ml di soluzione decontaminante, dove sono eliminati i puntali dopo l uso. Durante l esecuzione della prova, mantenere i campioni di DNA in esame in ghiaccio o supporto refrigerato. 1. Prendere i supporti speciali per provette e disporvi un numero di provette da 1,5 ml pari al numero di campioni/controlli in esame. 2. Distribuire in ogni provetta 41,4 µl di master mix (pari a 46µl meno un fattore di correzione del volume del 10%). 3. Prelevare dal ghiaccio le provette contenenti le sospensioni di DNA dei campioni da analizzare e dei controlli e trasferirle su un altro supporto speciale. 4. Agitare su vortex per circa 10 secondi ciascuna provetta e centrifugare alla massima velocità per pochi secondi, al fine di raccogliere sul fondo della provetta la sospensione della miscela di reazione. 5. Trasferire, nelle provette contenenti la master mix, un quantitativo di sospensione di DNA pari a 10,4 µl (volume ottenuto applicando gli stessi criteri di correzione dei volumi adottati per il calcolo del volume della master mix). In questo modo, ogni

8 BIOTECNOLOGIE pag 8 di 11 provetta conterrà un volume di miscela di reazione completa di DNA stampo pari a 51,8 µl. 6. Agitare su vortex per circa 10 secondi ciascuna provetta e centrifugare alla massima velocità per pochi secondi, al fine di raccogliere sul fondo della provetta la sospensione della miscela di reazione. 7. A seconda dello strumento utilizzato per l amplificazione e rivelazione, disporre sotto cappa: ABI 7900HT: - forbici - bustina contenente i tappi ottici - pinzette - micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp - strumento per l installazione dei tappi - supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti o per microprovette ABI 7900Fast - supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti - micropiastra ottica di reazione da 96 pozzetti MicroAmp per l ABI 7900HT Fast Real Time PCR - pellicola adesiva Optical adhesive film MicroAmp - pettine per il fissaggio della pellicola adesiva NB: Le piastre MicroAmp a 96 pozzetti sono diverse a seconda dello strumento utilizzato, assicurarsi di utilizzare il formato corretto. 8. Trasferire 25 µl di miscela di reazione completa di DNA stampo nei pozzetti della micropiastra secondo lo schema precedentemente definito e riportato a pagina 2 del POS VIR 017 INT/1. 9. Sigillare i pozzetti della piastra con la pellicola ottica adesiva o con i tappi ottici. 10. Estrarre la micropiastra di reazione dal supporto di base e trasferirla nell area di prova 313A o 221. Quarta fase Amplificazione e analisi dei dati Da eseguire nell area di prova 313A o 221. Disporre la micropiastra di reazione nell apposito vano dell ABI Prism 7900HT o dell ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System e procedere all avviamento della reazione come descritto dal manuale d uso dello strumento. Al termine dell amplificazione procedere all analisi, dopo aver preventivamente salvato la corsa, come di seguito descritto: 1. Impostare la linea di soglia: Impostare la modalità logaritmica per la rappresentazione delle curve di amplificazione. Impostare la linea di soglia nella zona dove i diversi profili di amplificazione risultano paralleli, cioè nella fase esponenziale di PCR. Passare alla modalità lineare e verificare che la linea di soglia precedentemente impostata si trovi nella fase geometrica di amplificazione.

9 BIOTECNOLOGIE pag 9 di Impostare la linea di base: In modalità lineare, impostare la linea di base 3 cicli prima del ciclo in corrispondenza del quale la linea di soglia incrocia la prima curva di amplificazione (ad es. se il Ct più piccolo è 25, impostare la linea di base a 22). 3. Esportare i dati in un file testo (TXT) e poi copiarli sul foglio di lavoro incolla del file excel POS VIR 017 INT monitor lectina. 4. Analizzare i risultati: sul foglio di lavoro risultati del file excel POS VIR 017 INT monitor lectina vengono riportati automaticamente i valori di Ct corrispondenti a ciascun pozzetto e i valori medi; per i campioni sottoposti a prova il foglio di lavoro calcola automaticamente anche il Ct tra le diluizioni testate. o Verificare che i controlli negativi presentino un Ct 40. In caso contrario la monitor run deve essere ripetuta, eventualmente dopo aver effettuato una nuova estrazione di DNA. o Verificare che il controllo positivo di estrazione, alla concentrazione maggiore, presenti un Ct non superiore al valore di 26, e che, tra le due concentrazioni, la differenza tra i Ct medi sia compresa tra 1,5 e 2,5. In caso contrario la monitor run deve essere ripetuta, eventualmente dopo aver purificato il DNA o effettuato una nuova estrazione di DNA, a seconda del caso. o Se la differenza tra i Ct medi delle diluizioni testate è 1,5 Ct, ciò indica che la soluzione di DNA estratto potrebbe contenere inibitori di PCR. In tal caso, se la qualità delle curve relative alla concentrazione più bassa è sufficientemente buona, utilizzare quest ultima concentrazione per le successive determinazioni, altrimenti ripetere la prova dimezzando il titolo di entrambe le concentrazioni. Se la differenza tra i Ct medi si mantiene 1,5 Ct, sarà necessario purificare il DNA oppure estrarre nuovamente il DNA dal campione (eventualmente utilizzando un metodo di estrazione più efficiente in termini di purificazione rispetto a quello precedentemente impiegato). o Se la differenza tra i Ct medi è 2,5 Ct, esaminare le curve di amplificazione relative alle due diverse concentrazioni di DNA considerate, per verificarne l andamento esponenziale ed effettuare le prove successive sulla concentrazione di DNA che presenta la migliore curva di amplificazione. o Il Ct LOD è calcolato come il Ct medio ottenuto dai due replicati di prova del controllo LOD. 9.4 Verifica fogli di calcolo Con cadenza semestrale l affidabilità del file excel POS VIR 017 INT monitor lectina utilizzato nella presente procedura viene verificata mediante l analisi di una corsa test standard ad esito noto denominata POS VIR 017 monitor test. Tutta la documentazione relativa a tali verifiche è conservata nell area di lavoro 200 in un apposito raccoglitore denominato OGM Verifica dei fogli di calcolo. 10. Espressione dei risultati Sono considerati positivi i campioni che presentano un valore di Ct medio Ct LOD. I campioni che non presentano segnali di amplificazione o presentano Ct > del Ct LOD sono considerati negativi per la presenza di DNA di soia.

10 BIOTECNOLOGIE pag 10 di 11 Esito Espressione del risultato 1 Assenza di amplificazione non rilevato DNA di soia Ct campione > Ct LOD 2 Ct campione Ct LOD rilevato DNA di soia I risultati dei replicati di estrazione devono essere concordanti. In caso contrario la prova deve essere ripetuta e se i risultati sono ancora discordanti, l esito deve essere espresso con la modalità 1 (non rilevato DNA di soia). Nel caso 1 deve essere indicato il LOD. 11. Validazione del metodo I calcoli relativi alle fasi descritte in questo paragrafo sono riportati nel modulo Foglio di lavoro per la validazione / verifica della capacita del laboratorio nell applicazione dei metodi di prova e di taratura e stima dell incertezza di misura relativo alla POS VIR 061 INT (VMSI POS VIR 061 INT) per la parte riguardante il sistema PCR real time lectina Determinazione del LOD (limite di rivelazione) Per la determinazione del LOD si procede seguendo le linee guida della ISO 24276:2006 determinando il più basso livello di analita (DNA bersaglio della reazione di PCR real time) in corrispondenza del quale lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ) è 33%. Nel nostro caso vengono utilizzati dati di ripetibilità intermedia (Eurachem Guide, 1998). Si opera come segue: Il DNA di soia (DNA bersaglio) estratto da materiali di riferimento viene diluito in acqua o in DNA di mais (DNA non bersaglio) Ciascuna diluizione viene esaminata in PCR real time per il sistema endogeno (lectina) in un numero di replicati maggiore o uguale a 5 Dai Ct medi ottenuti per ciascun gruppo di replicati si costruisce una retta di taratura Ct contro log (n copie genomiche): Ct = a log(numero di copie genomiche) + b dove a è la pendenza e b l intercetta della retta di taratura. Dalla retta di taratura si ricava, per ciascun replicato, il numero di copie genomiche corrispondente al valore del Ct Dal numero di copie genomiche di ciascun replicato si calcola il valor medio per gruppo di replicati ed il corrispondente scarto tipo; quindi si calcola lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ): x m = Σ x i /n i i σ = [Σ (x i x m ) 2 /(n - 1)] 0.5 RSD r = σ/x m 100 dove x m = numero di copie genomiche medio x i = numero di copie genomiche per il replicato i

11 BIOTECNOLOGIE pag 11 di 11 n = numero di replicati σ = scarto tipo RSD r = scarto tipo relativo di ripetibilità o coefficiente di variazione Tramite un modello di regressione si cerca la migliore funzione (coefficiente di regressione R 2 0,94) che descriva la relazione tra le RSD r ricavate e il numero di copie genomiche. Mediante interpolazione dalla curva ottenuta, si determina il valore del numero di copie corrispondente ad una RSD r pari al 33% La procedura viene ripetuta integralmente almeno un altra volta. Il LOD viene calcolato come media dei valori ottenuti. Come riportato nel VMSI POS VIR 061 INT, il LOD risulta pari a 20 copie genomiche (2C) per il sistema lectina Specificità e sensibilità La specificità è stata valutata come descritto nell annex C del UNI EN ISO 21570:2006, paragrafo C.1.2.3: mediante una ricerca di omologia di primer e sonde nei database GenBank/EMBL/DDBJ con il programma BLASTN per via sperimentale su materiali di riferimento certificati (IRMM-410) omissis contenenti soia Roundup Ready a concentrazioni comprese tra 0 e 5% e su matrici alimentari commerciali costituite o contenenti farina di soia o proteine di soia Linearità La linearità viene valutata allestendo diluizioni seriali di DNA di soia comprese tra circa 100 ng e circa 0,07 ng. Ciascun livello di diluizione viene analizzato almeno in duplicato. I Ct medi per livello e il logaritmo del numero di copie vengono utilizzati per il calcolo della retta di regressione e del relativo valore di R 2 Un valore di R 2 0,98 viene considerato accettabile per garantire la linearità di risposta. Il valore di R 2 è sempre risultato > di 0,98 per un intervallo di concentrazioni compreso tra 100 ng e 0,07 ng totali di DNA di soia.

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