Aggiornamenti di biologia molecolare nella diagnostica microbiologica. Pier Sandro Cocconcelli

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1 Aggiornamenti di biologia molecolare nella diagnostica microbiologica Pier Sandro Cocconcelli Istituto di Microbiologia Centro Ricerche Biotecnologiche Università Cattolica del Sacro Cuore Piacenza-Cremona

2 Il metodo analitico ideale per la microbiologia Accurato Sensibilità elevata Ripetibile e Riproducibile Rapido Quantitativo Analisi di grandi quantità di campione (25 g) Differenziazione tra cellule vive, morte e VNBC Validato e Riconosciuto Economico

3 Basati sulla crescita (UFC) Quantitativi Presenza/Assenza Limiti tempi fenotipo Specificità VNC virus Metodi tradizionali DNA-based technologies?

4 ante - PCR PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis Plasmid profiling rrna analysis

5 Polymerase Chain Reaction

6 Identificazione delle molecole bersaglio DNA - PCR Geni universali: S rdna RNA - RT-PCR Geni specifici: tossine, fattori di virulenza

7 16S 18S rrna Presente in tutte gli organismi cellulari Funzione conservata Presenza di regioni variabili e regioni conservate nella sua struttura Variazioni nella sequenza in funzione del tempo evolutivo OROLOGIO EVOLUTIVO

8 1 a Generazione dei saggi PCR primers specie specifici

9 2 a generazione dei sistemi di PCR diagnostica Eliminazione della visualizzazione degli ampliconi in gel di agarosio Sistemi di detection automatici

10 BAX

11 LISI 16 S SEQUENZA DELLA REGIONE 5 5

12 ANALISI DELLA SEQUENZA DEL 16 s rdna BACTERIA GRAM_POSITIVE_BACTERIA BACILLUS - LACTOBACILLUS - STREPTOCOCCUS_SUBDIVISION STREPTOCOCCI STC.SALIVARIUS_SUBGROUP STC.PNEUMONIAE_SUBGROUP Streptococcus thermophilus DSM (T) Streptococcus salivarius NCDO 1779 (T) Streptococcus salivarius ATCC Streptococcus gordonii ATCC (T)

13 PCR e Criteri Microbiologici Salmonella assenza in 25 g Listeria monocytogens assenza in 25 g 100 ufc/g Enterobacter sakazakii assenza in 10 g

14 PCR per l identificazione dei microrganismi negli alimenti Arricchimento Lisi delle cellule Analisi PCR Salmonella specie e sierotipi Listeria monocytogenes Campylobacter..

15 PCR in tempo reale: analisi quantitativa Valutazione on line dell amplificazione del DNA Rilevamento automatico della quantità del DNA (fluorescenza) Definizione di curve di taratura Software per il calcolo della quantità

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17 PCR quantitativa per il conteggio di Clostridium Soglia

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19 DNA MicroArrays: I sistemi di analisi ad alto flusso RNA RNA

20 Microarrays Diagnostici Presenza sullo stesso array di sonde per un numero elevato di microrganismi Sonde per geni universali (16S rdna) Geni specifici (tossine, fattori di virulenza) Coltivazione non necessaria Analisi di comunità microbiche complesse Analisi rapida (High Throughput processes)

21 Controllo Array patogeni

22 LIMITI DELLE TECNICHE PCR Cellule vive vs Cellule morte Arricchimento Nuove metodologie

23 Cellule vive vs Cellule morte DNA può persistere nelle cellule morte e nei prodotti alimentari mrna è : RNA è una molecola labile rapidamente degradata alla morte delle cellule Per la sua corta vita media l mrna è un buon indicatore di vitalità delle cellule

24 RT RNA DNasi DNA Taq RT-PCR L. monocytogens

25 The main technical limit of RT-PCR from microbial sample is the DNA contamination. RNA targets analysed by RT-PCR in a background of contaminating DNA could result in false positive. To overcome this problem DNA contamination must be removed enzymically by DNases treatments. The variability of the efficacy of this steps could introduce a bias in RT-PCR analysis -RT +RT -RT +RT

26 RT T7Pol T7 RNA Pol primer RNAseH RNA RT NASBA nucleic acid sequence based amplification

27 NASBA: Detection of pathogens in food Campylobacter Listeria monocytogenes Escherichia coli Salmonella enterica ser. Enteritidis Rotavirus

28 LIMITI DELLE TECNICHE PCR Falsi negativi: presenza di inibitori della PCR scarsa lisi delle cellule batteriche Falsi positivi Contaminazioni crociate

29 Controlli di PCR ISO Controllo negativo processo Controllo positivo processo Controllo negativo estrazione Controllo interno amplificaz. Controllo positivo PCR Controllo negativo PCR Trattamento del campione X X Estrazione DNA X X X Amplificaz. X X X X X X detection X X X X X X

30 LIMITI DELLE TECNICHE PCR Standardizzazione Validazione

31 Standardizzazione - Norme ISO Microbiology of food & animal feeding stuffs- Polymerase Chain Reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens: UNI EN ISO 22174:2005 Requisiti generali e definizioni ISO/TS 20836:2005 Performance testing for thermal cyclers ISO 20837:2006 Requirements for sample preparation for qualitative detection ISO 20838:2006 Requirements for amplification and detection for qualitative methods

32 EN ISO Validazione Microbiology of food & animal feeding stuffs Protocol of the validation of alternative methods. 2073/2005 Criteri Microbiologici: impiego di metodi alternativi

33 UNI EN ISO 22174:2005 Percorso analitico Organizzazione e suddivisione delle aree di lavoro Controlli

34 Conclusioni Tecniche DNA-based : continua sviluppo di nuove metodologie Elevata specificità Ottima riproducibilità / ripetibilità Cellule morte /cellule vive Quantità del campione da analizzare Dati quantitativi Addestramento Risorse Umane