Controllo e monitoraggio della sicurezza e qualità

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1 Strategie innovative rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli della IV gamma - STAYFRESH Controllo e monitoraggio della sicurezza e qualità Chiara Gorni, Donatella Allemand, Paola Mariani ( Convegno Conclusivo La mela di IV gamma, Bolzano, 05/09/2014

2 Prodotti di IV gamma: specificità Alimenti vegetali freschi (orticoli e frutticoli) sottoposti a minime lavorazioni che pur mantenendo invariate le caratteristiche organolettiche e sensoriali del prodotto fresco permettono di ottenere un prodotto pronto da consumare e semplice da utilizzare l umidità dell imballaggio è condizione favorevole allo sviluppo di microorganismi La bassa temperatura, come antimicrobico, é difficile da mantenere in continuo e microrganismi non patogeni possono svilupparsi Microrganismi patogeni per l uomo possono moltiplicarsi fino a livelli di rischio per i consumatori

3 Origine della contaminazione I patogeni più rilevanti per la IVgamma sono a trasmissione oro-fecale (connessi alla sfera animale), ma fonti dirette e indirette sono presenti in ogni fase del percorso dal campo alla tavola: pre-raccolta: suolo, acqua, concimi organici non ben compostati, contatto animale (incluso umano) raccolta: contatto umano e di altri animali, attrezzature di raccolta, contenitori e mezzi di trasporto, acqua post-raccolta: contatto umano, ambiente di lavorazione, contenitori e mezzi di trasporto, contaminazioni trasversali tra prodotti in fase di consumo

4 Fonti di contaminazione: Microrganismi patogeni (contaminanti occasionali) Batteri: Salmonella sp, Escherichia coli (O157:H7), Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Shigella sp, Aeromonas hydrophila Virus: epatite A, Noravirus batteri patogeni Salmonella, Listeria ed E. coli O157:H7 sono i patogeni più comuni

5 Controllo e sicurezza: i test I test possono essere sia di tipo microbiologico classico che molecolare (DNA) Limiti dei test attualmente in commercio: tempistiche superiori alle 24-48h limitato numero di patogeni identificati per test (test monopatogeno) identificazione solo a livello di specie matrice da analizzare

6 Test molecolare multipatogeno Il test mira ad identificare simultaneamente la presenza dei seguenti patogeni: Salmonella spp. Listeria spp. Escherichia Coli Il test consente anche di discriminare tra i diversi ceppi di questi patogeni, in modo da poter rin-tracciare la fonte della contaminazione La sensibilità del test e le sue tempistiche di identificazione, in presenza di patogeni multipli, deve essere rispondente alla normativa vigente

7 Illumina GoldenGate

8 Disegno del test Polimorfismi per i geni maggiormente informativi sono stati identificati mediante ricerca in banca dati e sequenziamento di ceppi commerciali Sono state selezionate 144 sequenze per il disegno delle sonde ma alcune sono state scartate per motivi tecnici

9 Ceppi batterici identificati SALMONELLA agona gallinarum miami reading typhi rubislaw typhimurium anatum hadar montevideo senftenberg typhisuis stanleyville virchow derby heidelberg muenchen enteritidis mbandaka tennessee weltevreden dublin indiana naestved paratyphi A paratyphi B thompson wien duisburg infantis pullorum livingstone emek tilene ESCHERICHIA COLI O157 O111 O103 O145 O26 LISTERIA ivanovii seeligeri monocytogenes grayii monocytogenes Div. I monocytogenes Div. II monocytogenes Div. III

10 Validazione del test 157 ceppi batterici, di campo o provenienti da ceppoteche commerciali, sono stati testati con il pannello Illumina: 98 ceppi di Salmonella 18 ceppi di Listeria 41 ceppi di Escherichia Coli È stata verificata: ripetibilità qualità estrazione del DNA La sensibilità del test è stata valutata per: numero minimo di CFU/ml rilevate numero di patogeni rilevati contemporaneamente

11 Risultati della validazione Le ibridazioni con i singoli ceppi batterici hanno mostrato la specificità delle sonde disegnate Utilizzando sia estratti crudi che estrazioni di DNA con kit, i dati ottenuti sono risultati robusti e ripetibili La ripetibilità del dato viene a mancare nel caso di contaminazioni inferiori a 20 CFU/ml o di miscele di DNA ottenute da più di 5 ceppi batterici

12 Limiti e prospettive L approccio tecnologico del test multipatogeno, che prevede l impiego della tecnologia GoldenGate, mostra limiti di tempistiche e sensibilità I recenti progressi nelle tecnologie molecolari permettono di ipotizzare il trasferimento delle conoscenze sviluppate ad una piattaforma maggiormente rispondente alle esigenze di un ciclo produttivo, come un lab-on-chip o un sistema miniaturizzato di next-generation sequencing (es. MinIon)

13 Test monopatogeno completo La normativa riguardante i patogeni alimentari richiede generalmente la rilevazione del patogeno (Salmonella spp., E.Coli, Listeria monocytogenes) senza la necessità di una loro sierotipizzazione Tuttavia nel caso di Salmonella la norma UNI EN ISO 6579 richiede, oltre all isolamento del batterio, anche una conferma biochimica o sierologica delle colonie isolate I test attualmente in commercio non sono in grado di fornire una soluzione tutto in uno con tempistiche compatibili con un ciclo produttivo Il test sviluppato per Salmonella risponde a questa necessità di isolamento e sierotipizzazione con tempi di risposta che variano dalle 24 alle 48 ore

14 Razionale del test diagnostico 1. PCR per i 3 geni selezionati (InvA, SafC e FimA) Marker S.Typhimurium LT2 CTR negativo FimA S.Typhimurium LT2 CTR negativo InvA S.Typhimurium LT2 CTR negativo SafC InvA SafC FimA 2. Purificazione delle singole bande di interesse IAC (controllo di amplificazione interno) 3. Sequenziamento 4. Sierotipizzazione mediante confronto delle sequenze con database pubblici e database proprietario

15 Test di inclusione Gene N ceppi testati Test di esclusione Selettività: inclusione ed esclusione inclusione ed esclusione N diversi sierotipi PCR per geni FimA InvA SafC Salmonella / / /138 Inclusività 100%: tutti i ceppi testati di S. enterica presentano almeno 2/3 dei prodotti di PCR (2 geni su 3), S. bongori 1/3 dei prodotti di PCR Esclusività: 96% per il gene FimA 100% per InvA e SafC Esclusività: 100% post sequenziamento

16 Accuratezza diagnostica: specificità e sensibilità 2.5 g di mela 1CFU S.typhimurium LT2 25ml BHI 16h a 37 C estrazione di DNA da 1 ml PCR per 3 geni S.typhimurium LT2+valerianella Valerianella in BHI CTR+ S.typhimurium LT2 S.typhimurium LT2+valerianella Valerianella in BHI S.typhimurium LT2+valerianella Valerianella in BHI CTR- CTR+ S.typhimurium LT2 CTR- CTR+ S.typhimurium LT2 CTR µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL FimA InvA SafC IAC Un alto grado di accuratezza diagnostica consente di rilevare in modo preciso e veritiero il microrganismo target in presenza di matrice biologica senza interferenza di microrganismi non target Marker

17 Limite di rilevabilità 25 g di mela in 250ml di BHI + 1CFU S. typhimurium LT2 2.5 g di mela in 25 ml di BHI CFU S. typhimurium LT2 Incubazione 37 C, 150 rpm, prelievi a tempi prestabiliti Non si hanno differenze nei risultati scalando le quantità 250 ml/25 g/1 CFU 25 ml/2.5 g/0.1 CFU PCR T=0h T=½h T=1h T=2h T=3½h T=4½h T=5½h T=22h Mela + S.typhimurium Mela FimA x x x x x x x x InvA x x SafC x x x x x x x x FimA InvA SafC IAC x x x x x x x x

18 Protocollo sperimentale Almeno 1 banda di interesse No bande interesse No Salmonella spp Riconoscimento sierotipo Sierotipizzazione in 48h in caso di sospetto positivo, risultati negativi in 24h

19 Trasferibilità, vantaggi e limiti Il test monopatogeno sviluppato per Salmonella può essere trasferito direttamente a laboratori di diagnostica, in quanto è stato disegnato secondo le indicazioni ISO 22174:2005, ISO 20837:2006, ISO 20838:2006 e risponde ai requisiti normativi (ISO 6579:2002) Il vantaggio di questo test è costituito essenzialmente dal fornire una unica soluzione per l isolamento e la sierotipizzazione, con tempistiche entro le 48h. Per come è stato concepito, può inoltre essere trasferito su di una piattaforma lab-on-chip Il limite di questo approccio di tipo molecolare (DNA) è costituito dalla presenza di falsi positivi nel caso di batteri morti. Sebbene questo non incida sulle tempistiche complessive del test, é comunque necessaria una conta microbica su piastra in caso di positività

20 Grazie per l attenzione