Tesi di Laurea. FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico

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1 Tesi di Laurea FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico IL CONTROLLO QUALITÀ NELLA PRODUZIONE FARMACEUTICA INDUSTRIALE: APPLICAZIONE DI UNA METODICA PER L ANALISI DEI PROBIOTICI VALIDATA DALL ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ Laureando: Luca Michelutti Relatore: Dott. Renzo Peressoni Correlatore: Dott. Franco Del Bianco

2 CENNI STORICI 1892 Döderlein propone l uso di lattobacilli nelle infezioni vaginali 1900 Henry Tissier isola bifidobatteri da feci di neonati allattati 1907 Metchnikoff teorizza l uso di batteri utili nel rimpiazzo di batteri dannosi nell intestino umano 1917 Nissle tratta salmonellosi e shigellosi con un ceppo di Escherichia coli non patogeno Ad oggi numerosi sono i microrganismi batterici e non definiti probiotici, e il numero è continuamente in crescita

3 DEFINIZIONE Microrganismi vitali che, somministrati in quantità adeguate, apportano benefici alla salute dell ospite (FAO/WHO, 2002)

4 IL MICROBIOTA INTESTINALE L apparato gastroenterico è colonizzato da cellule batteriche, con oltre 500 specie complessivamente Oltre a batteri sono presenti anche archeabatteri, eucarioti e virus Fornisce diversi contributi: Attività metaboliche Funzioni trofiche Funzione protettiva

5 MICRORGANISMI PROBIOTICI Un probiotico deve essere: Sicuro per l uomo Vitale ed efficace nell intestino umano Conferire benefìci fisiologici

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7 ALCUNI MICRORGANISMI PROBIOTICI Bifidobacterium spp Sono microrganismi Gram-positivi, a morfologia bastoncellare, anaerobi. Si trovano in diverse nicchie ecologiche tra le quali vi è l intestino umano.

8 Lactobacillus spp Sono microrganismi Gram-positivi, anaerobi facoltativi o microaerofili, a morfologia prevalentemente bastoncellare. Sono presenti anche nell uomo, soprattutto nel tratto gastrointestinale e nel tratto genitale femminile. Si suddividono in base alle loro caratteristiche in: omofermentanti (L. acidophilus), eterofermentanti facoltativi (L. paracasei) ed eterofermentanti obbligati (L. reuteri)

9 Bacillus coagulans È un microrganismo Gram-positivo, anaerobio tollerante, sporigeno. È una specie ubiquitaria in natura

10 IL RAPPORTO ISTISAN 08/36

11 MATERIALI E METODO DI LAVORO Prelievo e campionamento Identificazione genetica Conta batterica probiotica Conferma genetica e conta differenziale Controllo microbiologico Carica totale, carica di lieviti e muffe, carica di enterobatteri. Presenza di Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Salmonella.

12 RISULTATI Reagenti di PCR Concentrazione finale H2O distillata sterile ---- Buffer 10X 1 X MgCl2 25 mm 1,5 mm dntps 2,5 mm 0,2 mm Primer senso 100 µm 0,5 mm Primer antisenso 100 µm 0,5 mm DNA Da 1 µl a 5 µl Taq DNA polymerase 5U/µL 1,25 U Volume finale di 50 µl

13 Specie Primer Ciclo iniziale Denaturazione Annealing Estensione Cicli totali Ciclo finale B. coagulans Spo3 + Spo4 95 C x 5 min 95 C x 1 min 65 C x 1 min 72 C x 1 min C x 10 min Bifidobacterium spp BifidF + BifidR 96 C x 2 min 94 C x 30 sec 63 C x 40 sec 72 C x 30 sec C x 5 min L. acidophilus Idlc4F + Idl22R 94 C x 2 min 94 C x 20 sec 51 C x 40 sec 68 C x 30 sec C x 7 min L. paracasei W2 + Y2 94 C x 3 min 94 C x 45 sec 50 C x 45 sec 72 C x 1 min C x 5 min

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15 RISULTATI Microrganismo Terreno di coltura Bifidobacterium spp. Lactobacillus acidophilus Lactobacillus paracasei Condizioni di incubazione Temperatura di incubazione Tempo di incubazione MRS Anaerobiosi 37 C 72 h HHD Anaerobiosi 37 C 72 h MRS Anaerobiosi 37 C 72 h HHD Anaerobiosi 37 C 72 h MRS Anaerobiosi 37 C 72 h HHD Anaerobiosi 37 C 72 h

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17 RISULTATI Microrganismo Bacillus coagulans Terreno di coltura Condizioni di incubazione Temperatura di incubazione Tempo di incubazione TSA Aerobiosi 37 C Almeno 24 h Nutrient Agar Aerobiosi 37 C Almeno 24 h GYE Aerobiosi 37 C Almeno 24 h TSA Aerobiosi 44 C Almeno 24 h Nutrient Agar Aerobiosi 44 C Almeno 24 h GYE Aerobiosi 44 C Almeno 24 h TSA Aerobiosi 50 C Almeno 24 h Nutrient Agar Aerobiosi 50 C Almeno 24 h GYE Aerobiosi 50 C Almeno 24 h

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19 RISULTATI Brodo di coltura HHD MRS TSB Specie Bifidobacterium spp. Lactobacillus spp. Lactobacillus spp. Bacillus coagulans

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21 CONCLUSIONI Aspetti positivi del metodo Facilità d utilizzo Applicabilità per numerosi prodotti commerciali Limiti del metodo Tempi lunghi di analisi e metodiche superate Protocolli non sempre adatti Assenza di indicazioni per nuove specie probiotiche

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