S. Morabito - A. Benassi. Laboratori di prova per la sicurezza alimentare: esperienze, criticità e prospettive per l'accreditamento.

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Damiano Spinelli
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1 ISO 7218:2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs-general requirements and guidance for microbiological examinations. Implicazioni per il laboratorio e per la conduzione degli audit S. Morabito - A. Benassi

2 ISO 7218: Scope 2. Normative references 3. Premises 4. Installations and equipment 5. Personnel 6. Preparation of the equipment 7. Preparation and sterilization of culture media and reagents 8. Laboratory samples 9. Examination techniques and expression of results Annex A Confidence interval limits for estimated counts Annex B MPN tables ISO 7218: Scope 2. Normative references 3. Premises 4. Staff 5. Apparatus and equipment 6. Preparation of glassware and other laboratory materials 7. Preparation and sterilization of culture media 8. Laboratory samples 9. Examination 10. Enumeration 11. Detection method (qualitative) 12. Confirmation methods 13. Test reports 14. Validation of microbiological methods 15. Quality assurance of results/quality control of performance Annex A Properties of some disinfectants Annex B MPN tables

Premises 4. Staff 5. Apparatus and equipment 6. Preparation of glassware and other laboratory materials 7. Preparation and sterilization of culture media 8. Laboratory samples 9. Examination 10.

3 ISO 7218:2007 Third edition ISO 7218:1996 Second edition ISO 7218:1996 Second edition Amendment IMPIANTO GENERALE: La norma si arricchisce di informazioni relative a metodi e strumenti innovativi e alle norme correlate. 1. Scope: Guidance for accreditation of food microbiological laboratories (The IS describes the technical requirements according to Annex B of ISO/IEC 17025:2005)

relative a metodi e strumenti innovativi e alle norme correlate. 1.

4 IMPIANTO GENERALE: riferimenti normativi ISO 7218:1996 ISO 6887:1983, Microbiology- General guidance for the preparation of dilutions for microbiological examinations ISO 7218:2007 (Carattere generale) ISO 835 (Pipette graduate); ISO 6887 (all parts): ISO (apparati volumetrici); ISO/ TS (terreni colturali) ISO 7218:2007 (Norme specifiche) ISO 16140:2003 (Validazione metodi alternativi); ISO/TS 19036:2006 (Incertezza di misura) ISO 22174:2005 (Metodi molecolari)

graduate); ISO 6887 (all parts): ISO 8655-1 (apparati volumetrici); ISO/ TS 11133 (terreni colturali) ISO 7218:2007

5 Numerazione Number of Petri dishes per dilution Per i laboratori che operano in utilizzare una piastra per diluizione (almeno due diluizioni) Numero minimo di colonie per piastra: 10 (15 nella 7218:1996) (a) N= c/vx(n n 2 )xd 7218:1996 (b) N= c/vx1.1xd 7218: Method of calculation: low counts (meno di 10 colonie). Definizione del limite di determinazione: X=1/(w) 2 W= deviazione standard relativa =s(ds)/x W= 50%= limite di precisione relativa accettabile X=1/(0,50) 2 =4 I RISULTATI BASATI SU CONTE COMPRESE TRA 4 E 10 DOVREBBERO ESSERE CONSIDERATI SECONDO L ALGORITMO GENERALE (b) I RISULTATI BASATI SU CONTE INFERIORI A 4 DOVREBBERO ESSERE CONSIDERATI COME PRESENZA DEL MICRORGANISMO

Definizione del limite di determinazione: X=1/(w) 2 W= deviazione standard relativa =s(ds)/x W= 50%= limite di precisione relativa accettabile X=1/(0,50) 2 =4 I RISULTATI BASATI SU

6 INCERTEZZA DI MISURA ISO/TS 19036: SCOPO: E applicabile alle analisi quantitative Di prodotti per il consumo umano e animale Di campioni ambientali nell are della produzione degli alimenti Numerazione di microrganismi per colony counting techniques ma applicabile anche ad altri metodi alternativi strumentali Non è applicabile: Metodo MPN Analisi di bassi livelli di contaminazione Per i metodi qualitativi (presenza/assenza) l argomento è in discussione ISO/TC34/SC9

are della produzione degli alimenti Numerazione di microrganismi per colony counting techniques ma applicabile anche

7 INCERTEZZA DI MISURA ISO/TS 19036:2006 L incertezza standard combinata è stimata attraverso la deviazione standard sperimentale di riproducibilità sul risultato finale della misurazione 4.2 Tre differenti possibilità: deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio deviazione standard di riproducibilità del metodo derivata da uno studio interlaboratorio deviazione standard di riproducibilità del metodo derivata da un proficiency trial interlaboratorio 4.3 L incertezza estesa è derivata dalla incertezza standard combinata per un fattore di copertura K=2 (livello di confidenza del 95%)

2 Tre differenti possibilità: deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio deviazione standard di riproducibilità del metodo derivata da

8 INCERTEZZA DI MISURA ISO/TS 19036:2006 Sampling Equipment, culture media and reagents Subsampling/Primary Dilution Bias Laboratory Sample Results Matrix Residual Random Errors Operator/Time Black Box Approach

9 DS di riproducibilità intralaboratorio X Sampling Equipment, Culture media and Reagents Subsampling/Primary Dilution XBias Laboratory Sample Results Matrix Residual Random Errors Operator/Time

10 INCERTEZZA DI MISURA ISO/TS 19036: Protocollo sperimentale Dovrebbero essere incluse tutte le matrici analizzate nella routine di laboratorio Almeno 10 campioni per ciascuna matrice Quando possibile dovrebbero essere utilizzati campioni naturalmente contaminati Prove eseguite in condizioni diverse (Personale, lotti di terreni e reagenti differenti, strumenti, tempi etc.)

di laboratorio Almeno 10 campioni per ciascuna matrice Quando possibile dovrebbero essere

11 INCERTEZZA DI MISURA ISO/TS 19036: Protocollo sperimentale S R = 1/n (i=1-n) (y ia -y ib ) 2 /2 y ij = Dati in base logaritmica -log 10 (cfu/gr) (cfu/ml) i= indice del campione (da 1 a n per n 10) j= indice delle condizioni di riproducibilità (A o B)

12 DS di riproducibilità interlaboratorio X Sampling Equipment, Culture media and Reagents X Subsampling/Primary Dilution Bias Laboratory Sample Results XMatrix Residual Random Errors Operator/Time

13 DS di riproducibilità interlaboratorio Limitazioni dell approccio Solo un limitato numero di parametri di riproducibilità Sono stati derivati da studi interlaboratorio per i metodi standard di riferimento (ISO 7932, B. cereus; ISO 7937 C. perfringens; ISO e Staphilococchi coagulasi positivi; ISO L. monocytogenes) E difficile estendere i dati di precisione dagli studi interlaboratorio alle analisi di routine Le caratteristiche dei campioni (homogeneity requirements) riducono la variabilità naturale dei campioni contaminati

perfringens; ISO 6888-1 e 6888-2 Staphilococchi coagulasi positivi; ISO 11290-2 L.

14 DS di riproducibilità interlaboratorio (Proficiency trials) Il laboratorio può utilizzare la SD di riproducibilità da un proficiency test interlaboratorio per derivare la propria Incertezza a condizione che: Sia utilizzato il metodo applicato nella routine I campioni siano comparabili a quelli utilizzati nella routine I laboratori (o almeno la maggior parte di essi) utilizzino lo stesso metodo

condizione che: Sia utilizzato il metodo applicato nella routine I campioni siano comparabili a

15 ISO 7218: MPN La nuova edizione introduce per il laboratorio la possibilità di calcolare le MPN fornendo le formule Es. Formula approssimativa per tutti i casi MPN= Z p xm r / m s xm t Z p = numero tubi positivi M r = massa di riferimento del campione in grammi M s = massa totale, in grammi, del campione in tutti i tubi negativi M t = massa totale, in grammi, del campione in tutti i tubi Tuttavia definisce accettabile anche l utilizzo delle tabelle e dà indicazione di un software open source per il calcolo (MPN Assay Analyzer. Ref 29 nel testo)

grammi M s = massa totale, in grammi, del campione in tutti i tubi negativi M t = massa totale, in grammi, del campione in tutti i tubi

16 ISO 7218: Validation of microbiological methods 14.1 Validazione dei metodi di riferimento ISO/TC34/SC Validazione dei metodi di alternativi ISO 16140: Validazione dei metodi sviluppati dal laboratorio ISO/TC34/SC9

2 Validazione dei metodi di alternativi ISO 16140:2003 14.

17 ISO 7218: Quality assurance of results/performance 15.1 Valutazione continua (day-to-day basis) EA 4/10 Campioni contaminati artificialmente Campioni contaminati naturalmente (diverse matrici) Materiali di riferimento Esecuzione tests in replica Valutazione dei risultati in replica 15.3 External quality assessment

artificialmente Campioni contaminati naturalmente (diverse matrici) Materiali di

18 Grazie per l attenzione

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