Polymerase Chain Reaction - PCR

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1 Polymerase Chain Reaction - PCR

2 Real-Time PCR Saggio Saggio di PCR monitorato di continuo Tubi Tubi chiusi Nessuna analisi post PCR Nessuna elettroforesi Caratterizzazione del prodotto Possibilità di quantificare

3 TaqMan PCR Denaturazione Appaiamento Polimerizzazione forward primer R Q R = Reporter Q = Quencher

4 Real Time PCR

5 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Attualmente il Gold Standard per le analisi di tipizzazione molecolare Lenta Richiede specifiche conoscenze tecniche La lisi può essere differente per i vari microrganismi

6 1 2 3 Pulsed - Field Gel Electrophoresis Overnight cultures embedded In 1.0% agarose plugs Cell walls are lysed with ES (lysis) buffer Cellular proteins digested with Proteinase K 4 Xba I Plug exposed to infrequent cutting restriction enzyme Plugs loaded into 1.0% agarose gel Alternating pulsed electric field applied Stain with ethidium bromide and compare DNA fingerprints

7 L osservatorio delle infezioni in ospedale (IO) Sorveglianza degli alert organisms Sorveglianza e controllo dell emergenza emergenza Sorveglianza delle chemio- antibiotico-resistenze

8 L osservatorio delle infezioni in ospedale (IO) Il case finding ricerca sistematica di eventi a potenziale evoluzione epidemica Si avvale di sistemi informativi che utilizzano software dedicati rilevazione di variazioni della frequenza di isolamento di microorganismi ritenuti di particolare rilievo epidemiologico in quanto potenziali agenti di eventi epidemici

9 L osservatorio delle infezioni in ospedale (IO) La sensibilità di tale sistema potrebbe essere messa in crisi in caso di eventi epidemici sostenuti da: microorganismi non compresi nell elenco elenco degli alert organisms più specie microbiche, evento frequente in carenza di idonee condizioni igienico-sanitarie In tal caso la sorveglianza basata sulla frequenza di isolamento è insufficiente a rilevare un evento epidemico Varia la frequenza dei casi di infezione a piuttosto che uno specifico agente eziologico Definizione di caso????

10 L osservatorio delle infezioni in ospedale (IO) Eventi epidemici possono interessare trasversalmente più aree dell ospedale, oppure ospedali diversi circolazione di pazienti infetti o colonizzati tra aree diverse dell ospedale tipicamente il percorso: Pronto soccorso - rianimazione - degenza, con il coinvolgimento dei servizi diagnostici Necessità di tracciare le vie di diffusione per bloccare la diffusione di patogeni

11 Le infezioni nosocomiali e l epidemiologia molecolare Le tecniche molecolari sono diventate una parte fondamentale delle attività di controllo delle infezioni nosocomiali La pressione selettiva dell ambiente ospedaliero sulla normale flora batterica determina la comparsa di nuove difficoltà epidemiologiche che richiedono nuove soluzioni

12 Le infezioni nosocomiali e l epidemiologia molecolare Una Una delle prime applicazioni dei metodi di biologia molecolare in epidemiologia riguardarono lo studio delle infezioni nosocomiali Plasmid profling Shlaes et al. al. Plasmid analysis in molecular epidemiology: : a summary and future directions. Rev Infect Dis ;8: Georghiou et al. Molecular Molecular epidemiology of infections due to Enterobacter aerogenes: identification of hospital outbreak-associated associated strains by molecular techniques. Clin Infect 1995;20: Infect Dis.

13 Le infezioni nosocomiali e l epidemiologia molecolare In ambito nosocomiale bisogna rispondere a precise domande: Il cluster di infezione è causato da un singolo patogeno o gruppo di patogeni strettamente correlati? Oppure da cambiamenti correlati all ospite? immunocompromissione esposizione ad antibiotici Predisposizione dei pazienti coinvolti ad acquisire l infezione l da microrganismi commensali o saprofiti?

14 Le infezioni nosocomiali e l epidemiologia molecolare Di recente microrganismi tipicamente associati con le infezioni nosocomiali hanno cominciato ad apparire anche in ambito comunitario Questi microrganismi possiedono caratteristiche genetiche che hanno permesso loro di diffondersi ad ospiti differenti dai soggetti ospedalizzati?

15 Stratificazione dei dati disponibili La La tipizzazione molecolare permette di identificare e raggruppare gli agenti infettivi in sottotipi I I pazienti infetti da questi microrganismi (tipi) possono essere RICLASSIFICATI in accordo alle informazioni ottenute CIOÈ: : le informazioni di genotipizzazione possono consentire di stabilire una nuova definizione di caso

16 Stratificazione dei dati disponibili Particolarmente utile per quei pazienti ospedalizzati che sembrano manifestare malattia ad andamento sporadico o endemico All inizio questi pazienti possono essere stratificati considerando solo il microrganismo isolato

17 Stratificazione dei dati disponibili Successivamente, ogni strato può essere usato per definire i casi, i controlli, o un gruppo di confronto in uno studio caso-controllo controllo identificare i fattori di rischio per l infezionel CIOÈ: : quando uno strato può essere definito come un nuovo gruppo, ogni strato può allora essere usato per identificare un fattore di rischio unico Pertanto, la possibilità di stratificare ulteriormente crea le possibilità di identificare nuovi fattori di rischio

18 PFGE di MRSA

19 Le infezioni nosocomiali e l epidemiologia molecolare Una accurata indagine epidemiologica non può prescindere dalla tipizzazione dell agente eziologico Le tecniche di tipizzazione fenotipica trovano un applicazione sempre più limitata la tipizzazione molecolare sempre più si afferma come gold standard è differenziata in varie tecniche che trovano indicazioni elettive in relazione alla specie da tipizzare

20 Le infezioni nosocomiali e l epidemiologia molecolare Individuazione di centri di riferimento il problema assume connotazioni di carattere politico e organizzativo più generale su scala regionale e nazionale organizzati in livelli a seconda della complessità e dei costi delle tecniche analitiche Tale Tale organizzazione costituisce una garanzia di qualità Il centro di riferimento rappresenta un osservatorio epidemiologico privilegiato per monitorare la circolazione e le caratteristiche dei cloni epidemici Inoltre, copre le esigenze di un territorio molto più esteso di un ambito meramente locale

21 Le infezioni nosocomiali e l epidemiologia molecolare Occorre ricordare che l indagine l epidemiologica tradizionale locale è insostituibile e preliminare all invio di ceppi selezionati al centro di riferimento per la tipizzazione bio-molecolare

22 INDAGINE E SORVEGLIANZA EPIDEMIOLOGICA INCOMPLETA SENZA L APPLICAZIONE L DI APPROPRIATI STRUMENTI MOLECOLARI

23 Bioinformatica principi matematici (analisi computerizzata) applicati alla biologia (biologia( molecolare) Diverrà il più diffuso strumento per l analisi l dei sistemi biologici Banca dati elettronica dei profili molecolari

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