ALLwell Ingezim Gluten SemiQ (30.GSQ.K2)

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1 ALLwell Ingezim Gluten SemiQ (30.GSQ.K2) Test ELISA per rilevazione semi-quantitativa di glutine in campioni alimentari Cat. # LFD031 Manuale d uso ALLwell Ingezim Gluten SemiQ - Rev. 2 10/05/2019 1

2 1 Descrizione del kit Il kit Ingezim Gluten è un saggio immunoenzimatico basato sulla metodica del doppio anticorpo sandwich ELISA per la rilevazione del glutine in campioni alimentari. Il kit contine una piastra nei cui pozzetti è immobilizzato l'anticorpo monoclonale R5, che riconosce specificamente un epitopo comune per le gliadine, le secaline e le ordeine. L aggiunta del campione nei pozzetti della piastra permette all anticorpo di legarsi alle gliadine presenti nel campione. Dopo una fase di lavaggio, viene aggiunto un secondo anticorpo monoclonale R5 specifico per gliadina coniugato con una perossidasi. Questo anticorpo monoclonale coniugato si lega alle gliadine catturate e, dopo un ulteriore fase di lavaggio, l attività della perossidasi viene rilevata aggiungendo il substrato TMB. Il cambiamento da una soluzione di substrato incolore a un prodotto blu e poi, dopo l aggiunta della soluzione di stop, a giallo, viene misurato attraverso un lettore di piastre ELISA. Il contenuto di gliadina nei campioni è determinato per confronto tra gli OD dei campioni e quello del punto semiq. La sensibilità del test è 5 ppm di gliadina. 2 Contenuto del kit e Conservazione Conservare i reagenti a 2 8 C fino alla data di scadenza. NON CONGELARE. Evitare l esposizione del kit e dei suoi componenti alla luce diretta. Componenti del kit Quantità Conservazione Piastra con anticorpi 1 x 32-pozzetti (4 x 8 pozzetti) Punto semiq 1.5 ml Anticorpo coniugato alla perossidasi 5 ml Buffer di estrazione 50 ml Buffer di lavaggio 25X 65 ml 2 8 C Buffer di diluizione (DE12-05) 5X 65 ml Substrato TMB 15 ml Soluzione di stop (H2SO4 0.5M) * 15 ml * Questa soluzione è acida. Evitare il contatto con occhi e cute.in caso di contatto con la cute, lavare immediatamente con abbondante acqua. Un detergente delicato può essere utilizzato. In caso di contatto con gli occhi, lavare con abbondante acqua per almeno 15 minuti. Richiedere assistenza medica urgente se l irritazione persiste oppure è grave. 3 Materiali richiesti ma non forniti nel kit Etanolo 100% Acqua distillata 4 Avvertenze e Precauzioni Leggere attentamente le istruzioni d'uso Portare i reagenti a temperatura ambiente (22 25 C) prima dell uso. Non mescolare reagenti o manuali d uso tra kit diversi. Evitare la contaminaziomne dei reagenti del kit. Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza e non mescolare componenti di lotti diversi. Non mangiare, bere o fumare durante l utilizzo di reagenti e campioni. Non pipettare con la bocca. Utilizzare puntali nuovi per ogni campione. Includere sempre in ogni test i controlli e gli standard per la costruzione della curva. IMPORTANTE: Il substrato TMB deve essere maneggiato con cura dal momento che è molto sensibile alla luce e alla contaminazione; trasferire una quantità sufficiente per tutto il saggio dalla bottiglia in un altro contenitore oscurato. La soluzione di stop è un acido forte e deve, quindi, essere maneggiata con cura. 5 Preparazione delle soluzioni e dei reagenti Portare campioni e reagenti a temperatura ambiente prima dell uso. Preparare solo le soluzioni di cui si necessita per l esecuzione del test. Etanolo all 80%: mescolare 8 volumi di etanolo al 100% con 2 volumi di acqua distillata. Etanolo all 60%: mescolare 6 volumi di etanolo al 100% con 4 volumi di acqua distillata. Preparare i reagenti di cui si necessita appena prima dell esecuzione del test. Manuale d uso ALLwell Ingezim Gluten SemiQ - Rev. 2 10/05/2019 2

3 Mescolare tutti i reagenti invertendoli e agitandoli delicatamente prima dell uso. Preparare solo i volumi necessari all analisi che si sta per eseguire. Non rimettere i reagenti nei contenitori originali. Si consiglia di utilizzare contenitori monouso per la preparazione dei reagenti al fine di minimizzare il rischio di contaminazione. Soluzione di lavaggio 1X: mescolare 1 volume di soluzione di lavaggio 25X con 24 volumi di acqua distillata (una volta preparata la soluzione è stabile se conservata a 2-8 C). Buffer di diluizione 1X: mescolare 1 volume di buffer di diluizione 5X con 4 volumi di acqua distillata (una volta preparata la soluzione è stabile se conservata a 2-8 C). 6 Preparazione del campione Portare campioni e reagenti a temperatura ambiente prima dell uso. IMPORTANTE: per campioni contenenti cioccolato e per campioni ambientali deve essere utilizzato un protocollo di estrazione particolare. Contattare i tecnici Generon (ie.techsupport@generon.it). Prodotti sottoposti a trattamento termico oppure contenenti soia: 1. Pesare 0.25 g di campione alimentare macinato in un tubo da 15 ml 2. Aggiungere 2.5 ml di buffer di estrazione 3. Chiudere il tubo e ricoprire il tappo con parafilm per evitare l evaporazione 4. Vortexare accuratamente per 5 10 secondi 5. Incubare il tubo a 50 C per 40 minuti oppure a temperatura ambiente per 1 ora 6. Lasciar raffreddare per 5 minuti a temperatura ambiente 7. Aggiungere 7.5 ml di etanolo all 80% 8. Vortexare per secondi 9. Incubare tra 1 ora a temperatura ambiente in agitazione (è consigliato l uso di un agitatore a 45 rpm) 10. Centrifugare a g per 10 minuti a temperatura ambiente 11. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Prodotti non sottoposti a trattamento termico oppure non contenenti soia: 1. Pesare 0.25 g di campione alimentare macinato in un tubo da 15 ml 2. Aggiungere 10 ml di etanolo al 60% 3. Incubare 1 ora a temperatura ambiente in agitazione 4. Centrifugare a g per 10 minuti a temperatura ambiente 5. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo 7 Diluizione dei campioni Gli estratti ottenuti possono essere conservati per 7 giorni a temperatura ambiente tenendo ben chiusi i contenitori con parafilm per evitare l evaporazione. Gli estratti ottenuti devono essere diluiti prima del caricamento nei pozzetti della piastra. Per campioni teoricamente negativi: fare una diluizione 1/10 utilizzando il buffer di diluizione (900 μl di buffer di diluizione μl di estratto) Per i restanti campioni fare la diluizione che si ritiene necessaria Ad esempio, per verificare se il campione ha più o meno di 20 ppm di glutine, fare una diluizione 1/20 (950 μl di buffer di diluizione + 50 μl di estratto) Ad esempio, per verificare se il campione ha più o meno di 200 ppm di glutine, fare una diluizione 1/200 (1990 μl di buffer di diluizione + 10 μl di estratto) Se si desidera determinare la concentrazione di glutine con maggiore precisione, è necessario fare diverse diluizioni corrispondenti alle concentrazioni che si spera di trovare. Ad esempio, se si desidera sapere se un campione contiene tra 20 e 50 ppm di glutine bisogna fare la diluizione 1/20 (950 μl di buffer di diluizione + 50 μl di estratto) e quella 1/50 (980 μl di buffer di diluizione + 20 μl di estratto) Riassumendo, fare la diluizione corrispondente alla concentrazione a cui si è interessati oppure che ci si aspetta Manuale d uso ALLwell Ingezim Gluten SemiQ - Rev. 2 10/05/2019 3

4 8 Esecuzione del test ELISA 1. Trasferire 100 μl di punto semiq e di campioni in pozzetti diversi della piastra (si consiglia di eseguire le analisi in duplicato) 2. Chiudere la piastra e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente 3. Svuotare la piastra evitando la contaminazione tra i diversi pozzetti 4. Fare 6 lavaggi con 300 μl di soluzione di lavaggio 1X per ogni pozzetto (utilizzando un lavatore di piastre o una pipetta multicanale), agitando delicatamente la piastra mentre il buffer di lavaggio è nei pozzetti, svuotando la piastra e battendola su carta assorbente per una volta 5. Battere la piastra più volte su carta assorbente per eliminare completamente la soluzione di lavaggio 6. IMMEDIATAMENTE, aggiungere 100 μl di anticorpo coniugato in ogni pozzetto 7. Chiudere la piastra e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente 8. Svuotare la piastra evitando la contaminazione tra i diversi pozzetti 9. Fare 6 lavaggi con 300 μl di soluzione di lavaggio 1X per ogni pozzetto (utilizzando un lavatore di piastre o una pipetta multicanale), agitando delicatamente la piastra mentre il buffer di lavaggio è nei pozzetti, svuotando la piastra e battendola su carta assorbente per una volta 10. Battere la piastra più volte su carta assorbente per eliminare completamente la soluzione di lavaggio 11. IMMEDIATAMENTE, aggiungere 100 μl di substrato TMB in ogni pozzetto (si consiglia di utilizzare una pipetta multicanale) 12. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 minuti (si raccomanda di coprire la piastra durante l incubazione per evitare l esposizione alla luce) 13. Aggiungere 100 μl di soluzione di stop in ogni pozzetto seguendo l ordine di dispensazione del substrato (il colore passerà da blu a giallo) 14. Leggere la piastra a 450 nm il prima possibile e comunque entro 5 minuti con un lettore di piastre 9 Interpretazione dei risultati Validità del test Il test è valido se il valore di OD del punto semiq è tra 0.5 e 1.4. Calcolo dei risultati Il contenuto di glutine in un campione è determinato in base alla diluizione testata. Se l OD del campione è più alto dell OD del punto semiq, il campione ha un contenuto di glutine (in ppm) maggiore della diluizione testata. Se l OD del campione è più basso dell OD del punto semiq, il campione ha un contenuto di glutine (in ppm) inferiore alla diluizione testata. Se sono state testate due diluizioni e l OD del punto semiq è tra i due OD ottenuti dalle diluizioni, il campione ha una concentrazione di glutine (in ppm) compresa tra le due diluizioni testate. Informazioni aggiuntive La relazione tra gli OD ottenuti e ciascuna diluizione è all incirca lineare con il valore OD del punto semiq. Ad esempio, se l OD del campione è leggermente più alto oppure più basso dell OD del punto semiq, il contenuto di glutine in ppm è leggermente maggiore oppure minore, rispettivamente, della diluizione testata. Se al contrario l OD del campione è molto diverso da quello del punto semiq, la concentrazione di glutine è molto diversa da quella corrispondente alla diluizione testata. Se l OD del campione è compreso tra quelli di due diluizione testate, il contenuto di glutine in ppm è più simile alla diluizione il cui OD è vicino a quello del campione. Valori bassi di OD per il punto semiq generalmente sono associati alla temperatura di incubazione. La temperatura di incubazione deve essere compresa tra 22 e 25 C (preferibilmente vicina a 25 C). Manuale d uso ALLwell Ingezim Gluten SemiQ - Rev. 2 10/05/2019 4

5 10 Esempio (con lettore ELISA) OD del punto semiq = 0.62 Campione Diluizione Valori Densità Ottica (OD) ppm (1) Media Glutine (ppm) (2) A 1/ < 10 < 1.5 B 1/ < 10 7 C 1/ < D 1/25 1/ > 25 < 50 E 1/ > F 1/200 1/ > 200 < 300 G 1/ > (1) Risultati ottenuti con Ingezim Gluten SemiQ (2) Risultati ottenuti con Ingezim Gluten Interpretazione visiva È possibile interpretare visivamente i risultati. Si raccomanda di non aggiungere la soluzione di stop e interpretare i risultati 10 minuti dopo aver aggiunto il substrato TMB. Interpretare i risultati come segue: Se l intensità del colore del campione è minore di quella del punto semiq, il campione contiene una quantità di glutine in ppm inferiore alla diluizione testata. Se l intensità del colore del campione è maggiore di quella del punto semiq, il campione contiene una quantità di glutine in ppm superiore alla diluizione testata. Se l intensità del colore del campione risulta molto simile a quella del punto semiq, il campione contiene una quantità di glutine in ppm molto simile al valore numerico della diluizione testata. Il punto semiq dovrebbe avere una colorazione distinta. Se non c è alcuna colorazione per questo punto, il test deve essere considerato invalido e deve essere ripetuto. 12 Dichiarazione di non responsabilità Generon S.p.A. non si assume responsabilità di alcun tipo, esplicite o implicite, eccetto garantire che i materiali di cui i propri prodotti si compongono sono di qualità standard. In caso di materiale difettoso, Generon S.p.A. si impegna a fornire un prodotto sostitutivo. Generon S.p.A. non è tenuta a rispondere per qualunque danno, inclusi danni speciali o consequenziali o spese che derivano direttamente o indirettamente dall uso di questo prodotto. Generon S.p.A. Via San Geminiano, San Prospero (MO)- Italia : : : ie.techsupport@generon.it Manuale d uso ALLwell Ingezim Gluten SemiQ - Rev. 2 10/05/2019 5