BioOscientific. Manuale Utente. MaxSignal OchratoxinA test kit. Cat. # BOS Leggere attentamente questo inserto prima di utilizzare il prodotto

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1 BioOscientific MaxSignal OchratoxinA test kit Cat. # BOS Saggio ELISA per rilevazione di Ochratossina A Manuale Utente Leggere attentamente questo inserto prima di utilizzare il prodotto Via San Geminiano, San Prospero (MO)- Italy : : : techsupport@generon.it : [1] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

2 Indice 1 - INFORMAZIONI GENERALI Descrizione del prodotto Procedura generale Contenuto del kit, conservazione e durata Sensibilità (Limite di rilevazione) Specificità (Cross-reattività) Materiali necessari non inclusi nel kit Avvertenze e precauzioni 2 - ALLESTIMENTO DEL CAMPIONE Carne essiccata/pesce; Cereali; Mangimi e Sementi. 3 PROTOCOLLO DEL KIT Preparazione dei reagenti Protocollo test ELISA Calcolo della concentrazione di Ocratossina A 4 RISOLUZIONE DEI PROBLEMI Nessuno sviluppo del colore o Nessun segnale con gli standard Bassa lettura della densità ottica (OD) Elevato rumore di fondo o eccessiva densità ottica (OD) Alta variabilità Intra-Piastra Alta variabilità Inter-Piastra Uno o più punti della curva standard sono fuori dal range Il MaxSignal OchratoxinA ELISA Test Kit è da utilizzare unicamente in laboratorio tranne se diversamente indicato. Questo prodotto non è per un uso diagnostico clinico. MaxSignal è un marchio registrato di BioO Scientific Corporation (BIOO). [2] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

3 1 Informazioni Generali Descrizione del prodotto Il MaxSignal Ochratoxin A ELISA Test Kit è un saggio competitivo immunoenzimatico per l analisi quantitativa di Ocratossina A in cereali, carne essiccata/pesce; mangimi. L Ocratossina A (OTA) è una tossina prodotta da specie fungine dei generi Aspergillus e Penicillium. L esposizione umana si verifica principalmente attraverso il consumo di prodotti alimentari non conservati in maniera appropriata, in particolare cereali contaminati e prodotti a base di carne di maiale, così come il caffè, uva da vino e uva secca. La tossina si accumula nei tessuti e negli organi degli animali, incluso sangue umano e latte materno. Oltre all azione nefrotossica, l Ocratossina A mostra proprietà epatotossiche, cancerogene, immunosoppressive e immunotossiche. Il rischio per la salute umana non è dovuto solo all'assunzione di alimenti contaminati di origine vegetale ma anche attraverso l assunzione di alimenti di origine animale. Il MaxSignaI Ochratoxin A ELISA Test Kit consente alle agenzie di controllo governative e internazionali, ai produttori alimentari nonché agli enti di certificazione della qualità di rilevare Ocratossina A in vari campioni e soddisfare i clienti relativamente alla sicurezza alimentare. Le caratteristiche uniche del kit sono: Alto recupero (>80%), Alta sensibilità (0,2 ng/g o ppb) Saggio ELISA rapido (tempi di incubazione 15 minuti) Alta riproducibilità Procedura Generale Il metodo è basato su un saggio ELISA competitivo e colorimetrico. La tossina di interesse è inserito nei pozzetti della piastra. Durante il test, il campione viene aggiunto ai pozzetti insieme all anticorpo primario (Ocratossina A Anticorpo#1) specifico per il target ocratossina e all anticorpo secondario-coniugato con la perossidasi del rafano (Anticorpo2 Coniugato- HRP). Se un residuo di Ocratossina A è presente nel campione, competerà per l anticorpo, impedendo così che esso si leghi alla tossina legata al pozzetto. L anticorpo secondario coniugato all enzima HRP, si legherà all anticorpo primario a sua volta complessato alla tossina sul pozzetto. L intensità della colorazione che risulta dopo l aggiunta del substrato TMB ha una proporzionalità inversa alla concentrazione di Ocratossina A nel campione. [3] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

4 Contenuto del kit, conservazione e durata Il MaxSignaI Ochratoxin A ELISA Test Kit consente 48 determinazioni o test su 36 campioni in duplicato (supponendo di esguire 2 test ELISA con 18 campioni in duplicato). Riporre ogni micropozzetto inutilizzato nella confezione originale con il disseccante incluso. Conservare il kit a 2-8 C*. Il periodo di validità è di 12 mesi se il kit è correttamente conservato. Contenuto del kit Quantità Conservazione Piastra coattata con Ocratossina A 1x96 pozzetti (8 pozzetti x 12 strip) 2-8 C Ocratossina A Standard: Controllo Negativo (provetta tappo bianco) 0.2 ng/ml (provetta tappo giallo) 0.4 ng/ml (provetta tappo arancione) 0.6 ng/ml (provetta tappo rosa) 0.8 ng/ml (provetta tappo viola) 1.0 ng/ml (provetta tappo blu) 1000 ng/ml (provetta standard interno tappo rosso) 0.8 ml 2-8 C* Ocratossina A Anticorpo#1 7 ml 2-8 C* Anticorpo#2 Coniugato-HRP 7 ml 2-8 C* 20X Wash Solution ** 28 ml 2-8 C Substrato TMB ** 12 ml 2-8 C Stop Buffer ** 14 ml 2-8 C * Se non si utilizza il kit per oltre un mese, conservare gli Standard di Ocratossina, Ocratossina A Anticorpo#1 e Anticorpo#2 Coniugato-HRP in freezer a -20 C. ** Elementi con lo stesso codice BIOO entro la loro data di scadenza sono intercambiabili tra loro. Sensibilità (Limite di rilevazione) Campioni Sensibilità Carne essiccata/pesce; Cereali; Mangimi e Sementi 2 ppb Specificità (Cross-Reattività) Analiti Cross Reattività (%) Ocratossina A 100 Ocratossina B 9,3 [4] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

5 Principali materiali richiesti non inclusi nel kit Lettore di micropiastre (450 nm; codice ACC1028) Mixer Tessuti Pipette da 100 o 200 µl e 1000 µl Pipette Multi-canale da microlitri (codice ACC1018) Metanolo Avvertenze e Precauzioni BIOO raccomanda fortemente di leggere le seguenti avvertenze e precauzioni per assicurare la completa consapevolezza all utilizzatore circa le tecniche ELISA e altri dettagli verso i quali riporre attenzione durante l utilizzo dei saggi. Ulteriori informazioni possono essere trovate nella sezione Risoluzione dei problemi. Periodicamente, ottimizzazioni e revisioni vengono fatte al kit e al manuale. Di conseguenza, è importante seguire il protocollo in allegato al kit. Se si necessita di ulteriore assistenza, è possibile contattare immunolab@generon.it in qualità di distributore locale o BIOO all indirizzo techsupport@biooscientific.com. Gli standard contengono Aflatossina M1. Maneggiare con cautela. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza. GLI ANTICORPI E LE PIASTRE SONO SPECIFICHE PER IL KIT E LOTTO. Non mescolare reagenti provenienti da kit differenti, ad eccezione di componenti con lo stesso codice entro la loro data di scadenza. Mantenere una temperatura in laboratorio tra i 20 e i 25 C. Evitare di utilizzare i saggi in prossimità di correnti d aria, poiché ciò potrebbe causare un raffreddamento eccessivo, riscaldamento e/o evaporazione. Non utilizzare i saggi esponendosi direttamente al sole, poiché potrebbe causare un riscaldamento eccessivo ed evaporazione. Non lavorare su piani di lavoro freddi, eventualmente disponendo diversi strati di carta o altri materiali isolanti sotto alle piastre durante l incubazione. Assicurarsi di usare solo acqua distillata o deionizzata poiché la qualità dell acqua è molto importante. Quando si pipettano i campioni o i reagenti dentro una micropiastra vuota, posizionare il puntale nell angolo in basso del pozzetto, a contatto con la plastica. Le incubazioni delle piastre devono durare il più precisamente possibile. Essere precisi quando si aggiungono gli standard alla piastra. Aggiungere prima gli standard e poi i campioni. Aggiungere gli standard alla piastra in ordine dalla minor concentrazione alla più alta concentrazione, per minimizzare il rischio di contaminare la curva standard. Refrigerare sempre le piastre in contenitori sigillati con il dessiccante per mantenere una corretta conservazione. Per prevenire la formazione di condensa sulle piastre, portarle a temperatura ambiente (20-25 C) mentre sono nei contenitori. BIOO e Generon non offrono garanzie di nessun tipo, né espresse né implicite, ad eccezione dei materiali di cui i loro prodotti sono fatti, di qualità standard. Non ci sono garanzie di vendita per questo prodotto, o sull efficacia del prodotto per ogni applicazione. BIOO e Generon non sono responsabili per alcun danno, inclusi danni speciali o conseguenti, o spese direttamente o indirettamente dovute all uso di questo prodotto. [5] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

6 2 Preparazione del campione Assicurarsi che i campioni siano correttamente conservati. I campioni devono essere refrigerati a 2-4 C per non più di 1-2 giorni. Congelare i campioni ad un minimo di -20 C se devono essere conservati per un lungo periodo. I campioni congelati possono essere scongelati a temperatura ambiente (20-25 C) o in un frigorifero prima dell uso. Carne essiccata/pesce; Cereali; Mangimi e Sementi Macinare e miscelare un campione rappresentativo Pesare 5 g di campione macinato in un tubo falcon da 50 ml(codice ACC1508) Aggiungere 25 ml di Metanolo al 70% * e agitare vigorosamente per 3 minuti (Manualmente o con uno shaker) Filtrare l estratto su filtro di carta (ACC3504) Diluire 1 ml di campione filtrato ottenuto con 1 ml di acqua distillata o deionizzata Usare 50 µl di campione diluito per pozzetto per l esecuzione del test. *NOTE: Fattore di diluizione:10. La pesata del campione può essere aumentata se necessario, ma il volume di metanolo/acqua deve cambiare di conseguenza, ad esempio se si utilizzano 10 g di campione, devono essere aggiunti 50 ml di metanolo al 70%. 3 Test kit ELISA Ocratossina A Preparazione dei Reagenti IMPORTANTE: Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente prima dell uso (1-2 ore a C). Assicurarsi di avere letto la sezione Avvertenze e Precauzioni. Le soluzioni dovrebbero essere preparate subito prima del Test ELISA. Tutti i reagenti devono essere agitati vigorosamente prima dell uso. Preparare solo i volumi necessari per il numero di pozzetti che verranno utilizzati. Non rimettere i reagenti nella provetta/bottiglietta originale. È raccomandato l utilizzo di contenitori monouso quando si maneggiano i reagenti, per minimizzare il rischio di contaminazione. Preparazione di 1X Wash Solution: aggiungere 1 volume di 20X Wash Solution a 19 volumi di acqua distillata. Protocollo Test ELISA 1. Aggiungere 50 µl di ogni Standard di Ocratossina A in duplicato in pozzetti diversi. Aggiugere gli standard alla piastra solo nell ordine dal meno concentrato al più concentrato. 2. Aggiungere 50 µl di ogni campione in duplicato in pozzetti diversi. 3. Aggiungere 50 µl di Anticorpo#2 Coniugato-HRP a ciascun pozzetto, poi 50 µl di Anticorpo#1 e agitare la piastra manualmente per 1 minuto. 4. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). 5. Lavare la piastra 3 volte con 250 µl di 1X Wash Solution. Dopo l ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e delicatamente picchiettare per asciugarla su pezzi di carta. (Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro). [6] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

7 6. Aggiungere 100 µl di Substrato TMB. Incubare la piastra per 5 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Cronometrare la reazione facendo partire il timer subito dopo l aggiunta del substrato. Agitare manualmente la piastra per 1 minuto durante l incubazione a temperatura ambiente. (Non rimettere il substrato nella confezione originale per evitare potenziali contaminazioni. Se il Substrato TMB nella bottiglietta dovesse mostrare una qualunque colorazione, ciò è indicativo di un deterioramento e perciò la soluzione deve essere scartata). È consigliato coprire la micropiastra durante l incubazione. 7. Dopo l incubazione, aggiungere 100 µl di Stop Buffer per bloccare la reazione enzimatica. 8. Leggere le piastre il più presto possibile in seguito all aggiunta dello Stop Buffer su un lettore di micropiastre a lunghezza d onda 450 nm. (Prima della lettura, pulire il fondo della piastra con una salvietta per assicurarsi che né umidità né impronte digitali interferiscano con le letture). Calcolo della concentrazione di Ocratossina A È possibile costruire una curva standard logaritmica utilizzando le medie delle assorbanze relative (%) ottenute da ogni standard di riferimento e la loro concentrazione in ng/ml. Assorbanza relativa (%) = [assorbanza standard (o campione) / assorbanza zero standard] x 100 Usare le medie dei valori delle assorbanze relative per ogni campione per determinare dalla curva standard la corrispondente concentrazione della sostanza ricercata in ng/ml. Il programma MaxSignal ELISA in Excel è disponibile a richiesta per valutare i risultati del test. Contattare immunolab@generon.it per ulteriori informazioni. [7] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

8 6 Risoluzione dei problemi Nessuno sviluppo del colore o nessun segnale con gli standard I reagenti sono stati usati nell ordine scorretto o è stato saltato un passaggio. Sono stati usati anticorpi sbagliati o anticorpi deteriorati. Il TMB Substrato è deteriorato. Seguire attentamente il protocollo e ripetere il saggio. Assicurarsi che gli anticorpi utilizzati siano gli stessi inclusi nel kit. Tutti gli anticorpi sono kit e lotto specifici. Utilizzare un nuovo set di substrato BioO. Bassa lettura di Densità Ottica (OD) I reagenti erano scaduti o mescolati con un diverso numero di lotto. La soluzione di lavaggio NON è stata preparata correttamente. Sono stati eseguiti troppi cicli di lavaggio. I tempi di incubazione sono stati troppo corti. La temperatura del laboratorio era troppo bassa. I reagenti e le piastre erano troppo fredde. Il lettore era alla lunghezza d onda errata o era malfunzionante. Il kit ha subito stress termici eccessivi. Le piastre del saggio erano deteriorate. Verificare le date di scadenza e il numero di lotto. Usare la soluzione di lavaggio per il kit e assicurarsi che sia preparata correttamente. Assicurarsi di eseguire il numero di lavaggi delle istruzioni nel protocollo. Cronometrare i tempi separatamente per ogni piastra per assicurare un accurato tempo d incubazione. Seguire il protocollo. Mantenere il laboratorio con temperature tra i 20 e i 25 C. Non utilizzare i saggi sotto correnti di aria condizionata o vicino a finestre fredde. Assicurarsi che piastre e i reagenti siano portati a temperatura ambiente. Mantenere i componenti del kit fuori dalla scatola per minimo 1 ora prima di iniziare il saggio. Assicurarsi che la lunghezza d onda sia 450 nm per il saggio e leggere la piastra nuovamente. Verificare la calibrazione del lettore e l allineamento della lampada. Tenere nota di quante volte il kit è stato estratto dal congelatore. Controllare se il kit è stato lasciato a temperature estreme troppo a lungo. Refrigerare sempre le piastre in contenitori chiusi con dessiccanti per mantenerle stabili. Prevenire la formazione della condensa lasciandole equilibrare a temperatura ambiente (20-25 C) mentre sono nella confezione. [8] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

9 Alto rumore di fondo o alta Densità Ottica (OD) Nella soluzione di lavaggio è stata utilizzata acqua di scarsa qualità. Il TMB substrato era deteriorato. Ci sono stati insufficienti lavaggi o scarse performance di lavaggio. Lettore era malfunzionante o leggeva il bianco non correttamente. Ciò è altamente probabile se le letture delle OD erano alte e il colore non era intenso. La temperatura del laboratorio era troppo alta. I reagenti erano mischiati o preparati scorrettamente. Se la qualità dell acqua è dubbia, provare sostituendo con una fonte alternativa di acqua distillata per preparare la soluzione. Assicurarsi che il substrato fosse incolore prima di essere aggiunto alla piastra. Eseguire il numero di lavaggi indicati sul protocollo. Assicurarsi che almeno 250 µl di Wash Buffer sia stata distribuita nei pozzetti per il lavaggio. Verificare le performance del lavapiastre (se automatico); riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male. Verificare le performance del lettore usando una piastra contenente un calibratore e controllando l allineamento della lampada. Verificare la procedura di lettura del bianco ed eventualmente rieseguirne la lettura. Mantenere la temperatura ambiente tra i 20 e i 25 C. Evitare l utilizzo del test nei pressi di fonti di calore o esposizione diretta al sole. Assicurarsi che siano stati usati i reagenti corretti, che le soluzioni di lavoro siano state preparate correttamente e che non si siano verificate contaminazioni. Alta variabilità Intra-piastra La pipetta multicanale non funzionava correttamente. È stato eseguito non correttamente il lavaggio o la macchina lavapiastre è malfunzionante. Sono stati cronometrati male i tempi quando sono stati aggiunti gli standard, i reagenti o i campioni alla piastra. Verificare la calibrazione delle pipette e controllare che i puntali siano ben inseriti. Assicurarsi che tutti i canali delle pipette aspirino e dispensino egual volumi. Controllare le performance della macchina lavapiastre. Controllare i componenti della macchina. Riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male. Assicurarsi che tutti i materiali siano pronti all uso. Usare una pipetta multicanale per aliquotare i reagenti su più pozzetti quando possibile. Non interrompersi mentre si aggiungono standard, reagenti e campioni. [9] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017

10 Alta variabilità Inter-piastra È stato eseguito non correttamente il lavaggio. È stato eseguito non correttamente il lavaggio. La pipetta multicanale non funzionava correttamente. Piastre, reagenti, standard e campioni erano a temperature diverse. I reagenti usati erano di lotti differenti o i kit avevano differente data di scadenza. Cronometrare il tempo separatamente per ogni piastra per assicurarsi di un accurato tempo di incubazione. Assicurarsi di eseguire il numero di lavaggi indicati nel protocollo. Controllare i componenti della macchina lavapiastre. Riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male. Verificare la calibrazione della pipetta e controllare che i puntali siano ben inseriti. Assicurarsi che tutti i canali delle pipette aspirino e dispensino egual volumi. Assicurarsi di lasciare sufficiente tempo alle piastre, reagenti, standard e campioni per raggiungere la temperatura ambiente (20 25 C). Volumi maggiori richiedono maggiore tempo per andare a temperatura. Se si usa un bagno d acqua per velocizzare il procedimento, assicurarsi che sia mantenuta a temperatura ambiente; non usare un bagno caldo per scaldare reagenti, campioni e standard. Etichettare attentamente ogni reagente per assicurarsi che i reagenti non vengano mescolati. Kit con diverse date di scadenza possono generare diversi range di lettura della densità ottica, tuttavia, i valori delle assorbanze relative possono essere comparati molto bene. In generale, un valore con meno di 0.6 sullo standard zero può indicare un certo grado di deterioramento dei reagenti. Uno o più punti della curva standard sono fuori dal Range Gli Standard sono stati aggiunti nell ordine scorretto o registrati in posizione sbagliata. Gli standard erano contaminati o mescolati con altri standard. È stato eseguito non correttamente il lavaggio o la macchina lavapiastre è malfunzionante. Sono stati cronometrati male i tempi quando sono stati aggiunti gli standard, i reagenti o i campioni alla piastra. La pipetta multicanale non funzionava correttamente. Seguire il protocollo e rifare correre il saggio. Assicurarsi che gli standard siano aliquotati e registrati correttamente. Usare un nuovo set di standard. Aggiungere gli standard alla piastra solo nell ordine dal meno concentrato al più concentrato. Eseguire correttamente i lavaggi. Controllare i componenti della macchina lavapiastre. Riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male. Assicurarsi che tutti i materiali siano pronti all uso. Aggiungere gli standard alla piastra solo nell ordine dal meno concentrato al più concentrato. Usare una pipetta multicanale per aliquotare i reagenti su più pozzetti quando possibile. Verificare la calibrazione delle pipette e controllare che i puntali siano ben inseriti. Assicurarsi che tutti i canali delle pipette aspirino e dispensino egual volumi. [10] Manuale Utente - MaxSignal ELISA Kit Rev. 3 27/11/2017