RIDASCREEN Listeria. Test immunoenzimatico per la rilevazione di Listeria spp. Art. No.: R4202. Test in vitro Conservare a 2-8 C

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1 RIDASCREEN Listeria Test immunoenzimatico per la rilevazione di Listeria spp. Art. No.: R4202 Test in vitro Conservare a 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 Prodotto da: R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße 17 D Darmstadt Per informazioni: Telefono: Centralino ( ) Telefax / Ordini ( ) orders@r-biopharm.de Marketing ( ) info@r-biopharm.de Distribuito da: R-Biopharm Italia Srl Via Morandi, Melegnano MI Telefono info@r-biopharm.it - RIDA e RIDASCREEN sono marchi registrati della R-BIOPHARM AG Produttore: R-BIOPHARM AG, Darmstadt, Germania R-BIOPHARM AG è certificata ISO RIDASCREEN Listeria

3 RIDASCREEN Listeria Introduzione RIDASCREEN Listeria (Art. No.: R4202) è un immunodosaggio enzimatico per la rilevazione di Listeria spp. in alimenti e tamponi ambientali delle zone di produzione. Tutti i reagenti richiesti per il dosaggio immunoenzimatico sono contenuti nel kit. Il kit è sufficiente per 96 determinazioni (incluso il controllo positivo e negativo). Per l interpretazione dei risultati è necessario un lettore di micropiastre. Preparazione campioni: Tempo richiesto: Limite di rilevabilità: omogeneizzazione e arricchimento Arricchimento ± 2 h Esecuzione del test (ELISA)... 1 h 30 min Esecuzione del test, in totale... ca 49.5 ± 2 h (compreso l arricchimento) 1 cfu Listeria in 25 g di campione, pari ad almeno 10 5 cellule di Listeria/ml dopo arricchimento. 3 RIDASCREEN Listeria

4 1. Scopo RIDASCREEN Listeria (Art. No.: R4202) è un immunodosaggio enzimatico a sandwich per la rilevazione qualitativa di Listeria spp in colture pre-arricchite ottenute da campioni alimentari o dai tamponi dei piani di lavoro. Il prearricchimento deve essere eseguito mediante l uso di un appropriato metodo selettivo per Listeria spp (ad esempio arricchimento selettivo primario in brodo ½ Fraser seguito da arricchimento selettivo secondario in brodo Fraser). 2. Generale Il genera Listeria include 6 specie: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. innocua e L. grayi. La Listeria è un microrganismo ubiquitario nell'ambiente. E considerata come "germe della sporcizia " e si trova solitamente nelle acque di scarico, nei terreni, nell acqua contaminata nonché in alimenti e mangimi. La Listeria si rileva quasi sempre sulle piante contaminate con terreno o polvere. Quindi anche frutta, verdura e mangimi a base vegetariana posono essere fonti di infezione. I prodotti alimentari di origine animale sono invece per lo più colpiti da contaminazioni secondarie. Entrano in contatto con la Listeria durante il processo produttivo soprattutto il latte crudo ed i prodotti derivati da latte crudo, formaggi, maionese, salumi crudi, carne macinata cruda, pollame, salumi e pesce affumicato. Pertanto è necessario seguire scrupolosamente le comuni procedure di igiene industriale in fase di produzione o di trasformazione di questi prodotti alimentari. Tra le diverse specie di Listeria sopra indicate, la L. monocytogenes è conosciuta come la principale causa della cosiddetta listeriosi, una malattia soggetta a denuncia in esseri umani ed animali. In rari casi invece i ceppi L. ivanovii e L. seeligeri sono stati segnalati come responsabili di infezioni nell uomo. Negli animali la L. ivanovii è spesso rilevata come causa di malattie, in particolare nei piccoli ruminanti come pecore o capre. La listeriosi si trova raramente rispetto ad altre infezioni di origine alimentare (ad esempio campilobatteriosi e salmonellosi), ma è molto dannosa per la salute umana e spesso porta alla morte delle persone infette. Sono colpite principalmente le persone con sistema immunitario compromesso. I sintomi della malattia possono essere paragonati ad una lieve influenza con diarrea, ma anche sepsi, encefalite e meningite. Le infezioni delle donne in gravidanza può portare a nascite premature, abortiti e nascite di bambini con danni alla salute. 4 RIDASCREEN Listeria

5 3. Principio del test Il test si basa su una reazione antigene-anticorpo. I pozzetti della micropiastra sono rivestiti con anticorpi specifici contro gli antigeni di superficie di Listeria. In seguito all aggiunta del controllo positivi o del campione nei pozzetti, gli antigeni di Listeria presenti si legano agli specifici anticorpi di cattura e si forma il complesso antigene-anticorpo. Mediante una prima fase di lavaggio, vengono rimossi i componenti che non si sono legati. Successivamente, si aggiunge l anticorpo coniugato a perossidasi (enzima coniugato) che si lega al complesso antigene-anticorpo. Si forma così il complesso anticorpo-antigene-anticorpo (sandwich). Il coniugato che non si è legato viene rimosso mediante lavaggio. La rilevazione degli antigeni di Listeria avviene mediante l aggiunta della soluzione substrato/cromogeno. L enzima coniugato converte il cromogeno in un prodotto di colore blu. L aggiunta della soluzione di stop converte il colore da blu a giallo. La lettura viene eseguita fotometricamente a 450 nm/620 nm (lunghezza d onda di riferimento). Il campione deve essere considerato positivo se il valore di assorbanza è più elevato del valore soglia calcolato per i campioni positivi. 4. Reagenti forniti Ogni kit contiene reagenti sufficienti per 96 test: 1 x Micropiastra da 96 pozzetti (12 strip da 8 pozzetti ciascuna) rivestiti con anticorpi contro gli antigeni di Listeria spp 1 x Controllo positivo (2 ml)... tappo rosso contenente cellule inattivate di Listeria monocytogenes colore rosso, pronto all uso 1 x Controllo negativo (2 ml)... tappo bianco contenente cellule inattivate di Streptococcus faecalis incolore, pronto all uso 1 x Coniugato (10 ml)... tappo rosso anticorpi anti- Listeria spp coniugati con perossidasi, colore verde, pronto all uso 1 x Soluzione substrato/cromogeno (13 ml)... tappo marrone colore rosso, pronta all uso 1 x Soluzione di stop (13 ml)... tappo giallo contiene acido solforico 1N, pronta all uso 2 x Sali (tampone lavaggio) per la preparazione di tampone fosfato 10 mm (ph 7.4) contiene 0.05% di Tween 20 5 RIDASCREEN Listeria

6 5. Materiale richiesto ma non fornito 5.1. Attrezzatura: Bilancia da laboratorio Omogeneizzatore o equivalente (per l omogeneizzazione del campione) Sacchetti per omogeneizzatore o equivalente (filtro opzionale) Pipette da 100 µl e 1 ml Puntali monouso per pipetta Puntali monouso sterili per pipetta (per il trasferimento del terreno di coltura) Pipette da 10 ml (sterili) Provetta falcon da 15 ml (sterili) Incubatore regolabile a 30 ± 1 C (86 F) Opzionale: pipetta multicanale (250 µl ) o lavatore per micropiastre Cilindro graduato (1000 ml) Timer Carta da filtro Bagno d acqua (80 C/173 F) o equivalente per il trattamento termico dei campioni pre-arricchiti Lettore per micropiastre con filtro a 450 ± 10 nm/620 ± 10 nm 5.2. Reagenti: Acqua distillata Brodo Fraser base (si raccomanda: LabM, LAB164), supplemento selettivo ½ Fraser; supplemento selettivo Fraser (a seconda delle raccomandazioni del fornitore del brodo di base) A seconda della loro disponibilità, è possibile utilizzare anche terreni di coltura miscelati secchi e pronti all uso contenenti i supplementi richiesti. 6. Avvertenze e precauzioni Il kit RIDASCREEN Listeria deve essere utilizzato da personale id laboratorio qualificato. Le istruzioni per l uso devono essere seguite scrupolosamente. Durante la preparazione del campione, l esecuzione del test e lo smaltimento si raccomanda di seguire le buone pratiche di laboratorio e le linee guida GLP. Tutti i campioni devono essere trattati come materiali potenzialmente infettivi. Tutti i reagenti utilizzati, il tampone di lavaggio e le attrezzature da laboratorio che entrano in contatto con i campioni potenzialmente infettivi devono essere trattati con disinfettanti efficaci oppure sterilizzati in autoclave a 121 C (249.8 F) per almeno 15 minuti. 6 RIDASCREEN Listeria

7 I controlli positivi nonché quelli negativi contengono cellule batteriche inattivate. Tuttavia devono essere trattati come materiali potenzialmente infettivi. La soluzione di stop contiene acido solforico 1 N (R36/38, S2-26). Evitare il contatto con la cute. I controlli positivi e negativi contengono Kathon 0.1%. Evitare il contatto con la cute e con le mucose. 7. Conservazione Conservare il kit a 2-8 C. Non congelare alcun componente del kit. I pozzetti non utilizzati vanno richiusi nella loro confezione originale insieme all agente essiccante e conservati a 2-8 C. La soluzione substrato è fotosensibile, pertanto è bene evitare di esporla a luce diretta. Alla data di scadenza riportata in etichetta decade la garanzia di qualità del prodotto. Non scambiare singoli reagenti appartenenti a kit con diverso numero di lotto. 8. Indicazioni di instabilità e deterioramento dei reagenti Qualsiasi colorazione bluastra della soluzione substrato/cromogeno prima dell esecuzione del test Valori di assorbanza inferiori a 0.8 (A 450/620nm < 0.8) per il controllo positivo. 7 RIDASCREEN Listeria

8 9. Preparazione dei campioni I batteri del genere Listeria talvolta possono essere sensibili ai rapidi cambiamenti delle condizioni ambientali (temperatura, ph, ecc.). La Listeria presente come contaminante nei prodotti alimentari può essere danneggiata in modo sub-letale dai conservanti o da altri agenti e dai trattamenti alimentari. Pertanto i campioni devono essere pre-arricchiti prima che possano essere utilizzati in un test ELISA come RIDASCREEN Listeria. Come procedura di pre-arricchimento adatta alla Listeria spp. si raccomanda il metodo di arricchimento selettivo in due fasi secondo Fraser (Fraser JA e Sperber, W. H. 1988). In alternativa, per il prearricchimento di Listeria in alimenti, si può utilizzare un metodo idoneo paragonabile (ad esempio secondo la USDA, BAM, ISO, ecc). 9.1 Pre-arrichhimento secondo Fraser Preparare e sterilizzare in autoclave il brodo Fraser di base in un volume adeguato per la preparazione del brodo ½ Fraser (HFB) nonché del brodo Fraser (FB) secondo le istruzioni del fornitore (proporzione uguale a 22.5:1) Lasciare raffreddare il brodo a 50 C (122 F). Aggiungere metà supplemento selettivo concentrato per la preparazione di HFB al brodo di base designato e mescolare. Aliquotare il brodo FB in 10 ml per ciascuna provetta falcon. - Pesare 25 g di campione in un sacchetto per omogenizzatore, aggiungere 225 ml di HFB ed omogenizzare - Ripiegare la parte superiore del sacchetto e sigillarlo con un nastro o con un apposito fermaglio - Incubare per 24 ± 2h a 30 ±1 C (86 F) - Terminato il periodo di incubazione, trasferire 0.1 ml della coltura in una provetta falcon contenente 10 ml di FB - Incubare la provetta per 24 h a 30 ±1 C (86 F) 8 RIDASCREEN Listeria

9 10. Esecuzione del test Indicazioni preliminari Prelevare una aliquota appropriata di campioni pre-arricchiti e conservarli per possibili ulteriori analisi (ad esempio per testare la presenza di L. monocytogenes). Riscaldare il rimanente campione pre-arricchito per 20 min a 80 C (176 F) in un bagno d acqua prima dell esecuzione dell analisi. Portare tutti i reagenti ed i campioni pre-arricchiti a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F) prima dell uso. Come tampone di lavaggio è necessario un tampone PBS tween. Si prega di utilizzare i sali contenuti nel kit (vedi paragrafo 4). Sciogliere l intero contenuto di una bustina in un litro di acqua distillata. Il tampone di lavaggio pronto all uso scade dopo circa 4 6 settimane a 2-8 C (36-46 F). In alternativa: Sciogliere il contenuto di una bustina in 100 ml di acqua distillata per ottenere un tampone di lavaggio concentrato 10x. Utilizzare 1 parte di questo tampone concentrato con 9 parti di acqua distillata per ottenere un tampone di lavaggio pronto all uso. Il tampone di lavaggio concentrato 10x scade dopo circa 8-12 settimane, conservazione a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F) Procedura del test Seguire scrupolosamente le procedure di lavaggio raccomandate. Non lasciare asciugare i pozzetti della micropiastra durante le diverse fasi di lavoro. 1. Preparazione della piastra: introdurre i pozzetti necessari per i campioni ed i controlli nel supporto della micropiastra. Rimettere i pozzetti inutilizzati nella busta e richiudere. 2. Aggiunta del campione: utilizzando un puntale nuovo per ogni campione, trasferire nei singoli pozzetti aliquote da 100 µl dei campioni pre-arricchiti, del controllo negativo e del controllo positivo, registrando la posizione di ciascuno. Coprire i pozzetti con la pellicola in plastica ed incubare per 30 minuti a 37 C (98.6 F). 3. Primo lavaggio: Svuotare i pozzetti capovolgendo e picchiettando il supporto rigido della micropiastra vigorosamente (per tre volte di seguito) contro carta assorbente per assicurarsi la completa rimozione del liquido dai pozzetti. Riempire tutti i pozzetti con 250 µl di tampone di lavaggio (vedi paragrafo 10.1) e rimuovere nuovamente tutto il liquido. Ripete l operazione per altre 5 9 RIDASCREEN Listeria

10 volte. La procedura può essere eseguita manualmente oppure utilizzando una pipetta multicanale. Il lavaggio accurato dei pozzetti è un operazione cruciale del test, essenziale per ottenere una chiara interpretazione dei risultati. 4. Aggiunta del coniugato: addizionare 100 µl di coniugato in ogni pozzetto completamente svuotato. Coprire i pozzetti e incubare per 30 minuti a 37 C (98.6 F). 5. Secondo lavaggio: Svuotare i pozzetti e lavare per sei volte con 250 µl di soluzione di lavaggio (vedi la procedura indicata al punto 3). 6. Aggiunta del substrato: Assicurarsi che i pozzetti siano vuoti prima di procedere. Addizionare 100 µl di substrato/cromogeno in ogni pozzetto completamente svuotato. Coprire i pozzetti e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F) e al buio. 7. Fermare la reazione: Aggiungere 100 µl di soluzione di stop ad ogni pozzetto e miscelare delicatamente muovendo manualmente la piastra. 8. Lettura: I valori di assorbanza vengono letti a 450± 10nm/620±10 nm (lunghezza d onda di riferimento), entro 30 minuti dall aggiunta della soluzione di stop. 11. Risultati Per i saggi immunoenzimatici RIDASCREEN è disponibile un apposito software di valutazione denominato RIDA SOFT Win (Cod. Z9999) Controllo di qualità per la validità del test: Il controllo positivo deve aver raggiunto un valore di assorbanza uguale o superiore a 0.8 Il controllo negativo deve avere un valore di assorbanza inferiore a 0.2 Se questi criteri non sono soddisfatti, eseguire le seguenti verifiche e apportare le opportune correzioni prima di ripetere il test: Controllare la data di scadenza del kit. Accertarsi che i componenti del kit abbiano avuto il tempo sufficiente per raggiungere la temperatura ambiente. Controllare che venga sempre usato un puntale per pipetta nuovo per ciascun campione o controllo, al fine di evitare cross contaminazioni Verificare la sterilità dell acqua utilizzata per la preparazione del tampone di lavaggio 10 RIDASCREEN Listeria

11 Assicurarsi che le sequenze di lavaggio siano state eseguite correttamente (vedi ) Verificare eventuali contaminazioni delle pipette (pulire regolarmente le pipette/utilizzare pipette mono uso) Determinazione del valore soglia Per la determinazione del valore soglia, è necessario aggiungere 0.15 unità di assorbanza al valore di assorbanza del controllo negativo. Esempio: Controllo negativo = Valore soglia = = Interpretazione dei risultati I campioni che hanno un valore di assorbanza più del 10% superiore al valore soglia devono essere considerati positivi. I campioni con un valore di assorbanza nell'intervallo del 10% superiore o inferiore al valore soglia devono essere considerati borderline. In questo caso l'analisi deve essere ripetuta utilizzando un pre-arricchimento fresco. Se questa seconda analisi porta nuovamente ad un risultato borderline, il campione deve essere considerato negativo Se l'assorbanza di un campione è più del 10% sotto al valore soglia il campione deve essere considerato negativo. R-Biopharm non fornisce alcuna garanzia, esplicita o implicita, oltre a quella relativa alla qualità standard dei materiali di cui sono costituiti i suoi prodotti. Nel caso tali materiali risultassero difettosi, R-Biopharm si impegna a fornire prodotti sostitutivi. Non esiste garanzia di commerciabilità o di idoneità del prodotto per uno scopo particolare. R-Biopharm non è da ritenersi responsabile per danni, ivi compresi danni speciali o indiretti, o spese derivanti direttamente o indirettamente dall utilizzo del prodotto. 11 RIDASCREEN Listeria