RIDASCREEN Acetylgestagene Art. Nr. R1801

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1 RIDASCREEN Acetylgestagene Art. Nr. R1801 Test immunoenzimatico per l analisi quantitativa di acetilgestageni Test in vitro Conservare a 2-8 C

2 Prodotto da: R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße 17 D Darmstadt Per informazioni: Centralino: Telefono: +49 (0) Ufficio ordini: Fax: +49 (0) Marketing & Sales Telefono: +49 (0) Distribuito da: R-Biopharm Italia Srl Via Morandi, Melegnano MI Telefono RIDA e RIDASCREEN sono marchi registrati della R-BIOPHARM AG Produttore: R-BIOPHARM AG, Darmstadt, Germania R-BIOPHARM AG è certificata ISO RIDASCREEN Acetylgestagene

3 RIDASCREEN Acetylgestagene Introduzione Il test RIDASCREEN Acetylgestagene è un immunodosaggio enzimatico competitivo per l'analisi quantitativa del medrossiprogesterone acetato (MPA) e altri acetilgestageni in campioni di tessuto perirenale adiposo bovino. Tutti i reagenti richiesti per il dosaggio - inclusi gli standard - sono nel kit. Il kit è sufficiente per 96 determinazioni (inclusi gli standard). Per la quantificazione è richiesto uno spettrofotometro per micropiastre. Preparazione campioni: Tempo richiesto : Limite di rilevabilità: (corrispondente alla sostanza standard) estrazione (durante la notte), centrifugazione, evaporazione, congelamento, centrifugazione, purificazione cromatografica con colonne RIDA C18 (Art. No.: R2002) preparazione dei campioni (10 campioni)... ca. 18 h esecuzione del test (tempo d incubazione) h Medrossiprogesterone acetato... 0,3 µg/kg (ppb) 17α-acetossiprogesterone... 0,24 µg/kg (ppb) Megestrolo acetato... 0,6 µg/kg (ppb) Clormadinone acetato... 0,6 µg/kg (ppb) Recupero: per controlli arricchiti negativi... ca. 65 % (corrispondente alla sostanza standard) La specificità di RIDASCREEN Acetylgestagene è stata determinata analizzando i valori di cross-reattività delle sostanze corrispondenti in un sistema tampone. Nei campioni la specificità può differire da quella determinata in un sistema tampone a causa dell effetto matrice. Prima dell analisi delle sostanze cross-reattive, è necessario determinare il limite di rilevabilità ed i valori di recupero delle sostanze nel rispettivo campione. Il test non è in grado di discriminare tra analita e sostanza cross-reattiva. RIDASCREEN Acetylgestagene

4 Specificità: medrossiprogesterone acetato % 17α acetossiprogesterone % megestrolo acetato... 50% clormadinone acetato... 50% melengestrolo acetato...0,6% cross-reattività con altre sostanze testate... 0,002% Al fine di aumentare la qualità delle prestazioni durante l'esecuzione di procedure ELISA, si prega di far riferimento al nostro Good ELISA Practice (GEP) Manual, nella versione aggiornata. Qui si elencano gli standard minimi riguardanti le condizioni di lavoro quando si utilizzano i kit di R-Biopharm AG e si eseguono test ELISA. Il manuale può essere visionato, stampato e scaricato direttamente dal nostro sito Prodotti correlati: RIDA Acetylgestagene Spiking Solution... (R1899) RIDASCREEN Melengestrolacetat... (R6502) RIDA Melengestrolacetat Spiking Solution... (R6599) 1. Scopo RIDASCREEN Acetylgestagene è un immunodosaggio enzimatico competitivo per l'analisi quantitativa di medrossiprogesterone acetato (MPA) e altri acetilgestageni nel tessuto adiposo perirenale bovino. 2. Generale Il medrossiprogesterone acetato (MPA), il 17α-acetossiprogesterone, il megestrolo acetato e il clormadinone acetato appartengono al gruppo degli acetilgestageni. Gli acetilgestageni sono noti per aumentare l'efficienza nella produzione del bestiame e sono stati utilizzati in miscele illegali nell'ingrassamento dei vitelli. Essi però non sono autorizzati per l'ingrassamento del bestiame. Alcuni studi hanno dimostrato che picchi di concentrazione di acetilgestageni residui si possono osservare nel tessuto adiposo. L'MPA, per esempio, può essere riscontrato nel plasma solo alcuni giorni dopo il trattamento, ma non può essere rilevato con precisione nelle urine. Comunque si possono riscontrare alte concentrazioni di MPA non metabolizzato nel tessuto adiposo di vitelli trattati anche dopo 19 giorni. 4 RIDASCREEN Acetylgestagene

5 3. Principio del test I pozzetti della micropiastra sono rivestiti con anticorpi di cattura diretti contro gli anticorpi anti-acetilgestagene. Vengono aggiunti: anticorpi anti-acetilgestagene, MPA coniugato con enzima e soluzioni standard di acetilgestagene o campioni. L'acetilgestagene libero e l'mpa coniugato con enzima competono per i siti di legame degli anticorpi anti-acetilgestagene (immunodosaggio enzimatico competitivo). Contemporaneamente gli anticorpi anti-acetilgestagene vengono legati dagli anticorpi di cattura immobilizzati. L'enzima coniugato non legato viene rimosso con il lavaggio. L'enzima substrato (urea-perossidasi) e il cromogeno (tetrametilbenzidina) vengono aggiunti ai pozzetti e incubati. L'enzima coniugato legato converte il cromogeno incolore in un prodotto blu. L'addizione della soluzione di stop determina il viraggio del colore dal blu al giallo. La misurazione fotometrica viene eseguita a 450 nm. L'assorbimento è inversamente proporzionale alla concentrazione di acetilgestagene nel campione. 4. Reagenti forniti Ogni kit contiene materiale sufficiente per 96 analisi (incluse le analisi degli standard). Ogni kit contiene: Componente Colore del tappo Formato Quantità Micropiastra - Pronto all uso 96 pozzetti Standard 1 Bianco Pronto all uso 0 µg/l 1.3 ml Standard 2 Bianco Pronto all uso 0.15 µg/l 1.3 ml Standard 3 Bianco Pronto all uso 0.45 µg/l 1.3 ml Standard 4 Bianco Pronto all uso 1.35 µg/l 1.3 ml Standard 5 Bianco Pronto all uso 4.05 µg/l 1.3 ml Standard 6 Bianco Pronto all uso µg/l 1.3 ml Conjugate Rosso Concentrato 0.7 ml Antibody Nero Concentrato 0.7 ml Conjugte/antibody buffer Bianco Pronto all uso 25 ml Substrate Verde Pronto all uso 7 ml Chromogen Blu Pronto all uso 7 ml Stop solution Giallo Pronto all uso 14 ml RIDASCREEN Acetylgestagene

6 5. Materiale richiesto ma non fornito 5.1. Attrezzatura: spettofotometro per micropiastre (450 nm) ultra turrax bagno termostatato (40 C o 60 C / 104 F o 140 F) congelatore (-60 C / -140 F) centrifuga refrigerata e relativi vial pipette graduate micropipette da 20 µl 200 µl e µl colonne RIDA C18 (Art. No.: R2002) 5.2. Reagenti: etere di petrolio metanolo Tris-HCl 20 mm, ph 8,5 soluzione metanolo / tris HCl (20/80 v/v): disciogliere 2,42 g di tris- (idrossimetil)-aminometano in circa 700 ml di acqua distillata ml di metanolo (100%) e regolare il ph a 8,5 con HCl 5M. Portare a volume (1 litro) con acqua distillata Tween 20 (Sigma, cod. P-2287) 6. Avvertenze e precauzioni per gli utilizzatori Questo test dovrebbe essere effettuato solo da personale di laboratorio qualificato. Le istruzioni per l'uso devono essere rispettate rigorosamente. Il kit può contenere sostanze pericolose. Per ulteriori informazioni sulla sostanze contenute, far riferimento alla scheda di sicurezza (MSDS) scaricabile direttamente online al sito 7. Conservazione Conservare il kit a 2-8 C (35-46 F). Non congelare alcun componente del kit. Riporre i pozzetti non utilizzati nella loro custodia originale insieme al disseccante in dotazione e conservarli a 2-8 C (35-46 F). Il cromogeno incolore è fotosensibile: evitarne l'esposizione alla luce diretta. 6 RIDASCREEN Acetylgestagene

7 La qualità del prodotto non è garantita oltre la data di scadenza riportata sull etichetta. Non scambiare singoli reagenti di kit aventi diverso numero di lotto. 8. Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti Qualsiasi colorazione della soluzione substrato/cromogeno prima dell esecuzione del test Valori inferiori a 0,6 unità di assorbanza (A 450 < 0,6) per lo standard 1 9. Preparazione dei campioni 9.1. Tessuto perirenale adiposo bovino tritare il grasso del rene congelato grattandolo con un bisturi pesare 1 g di campione in un vial da 20 ml per l estrazione e aggiungere 15 ml di etere di petrolio. Agitare delicatamente in un bagno termostatato a 40 C (104 F) per tutta la notte centrifugare l'estratto per 15 min. a circa 2000 g e a -15 C (-59 F) (se non è disponibile una centrifuga refrigerata, congelare il campione prima della centrifugazione) decantare il surnatante di etere di petrolio in un nuovo vial ed evaporarlo nel bagno termostatato a 60 C (140 F) o in un altro sistema per evaporazione risospendere il residuo in 2 ml di metanolo e vortexare per 20 secondi (chiudere bene il tappo) congelare per 45 minuti a -60 C (-140 F) per l'eliminazione del grasso centrifugare per 5 minuti a ca g e a -15 C (-59 F) e decantare il surnatante in un nuovo vial diluire il surnatante metanolico con 5 ml di acqua distillata e purificare con le colonne RIDA C18 (R2002) seguendo il protocollo riportato: flusso: 1 goccia/secondo lavare la colonna per due volte utilizzando ogni volta 1 ml di metanolo 100% equilibrare due volte con 1 ml di metanolo/20 mm Tris-HCl, ph 8,5 (20/80 (v/v)) applicare il campione (circa 7 ml) lavare due volte la colonna con 1 ml di metanolo/20 mm Tris-HCl ph 8,5 (20/80 v/v) lavare due volte la colonna con 1 ml di metanolo/acqua distillata (40/60 (v/v)) RIDASCREEN Acetylgestagene

8 rimuovere tutto il liquido residuo con una pressione positiva o mediante vuoto e asciugare la colonna sottoponendola per due minuti a getto di aria o azoto eluire con 1 ml di metanolo/acqua distillata (80/20 v/v) in un nuovo vial raccogliere i residui applicando una pressione positiva o il vuoto diluire l'eluato 1:1 con acqua distillata per ottenere una soluzione metanolo /acqua 40/60 (v/v) nel saggio utilizzare 20 µl per pozzetto Nota: A seconda della concentrazione di acetilgestagene potrebbero risultare necessarie ulteriori diluizioni. In tal caso utilizzare una soluzione metanolo/acqua distillata (40/60 v/v) per ogni ulteriore diluizione. 10. Esecuzione del test Indicazioni preliminari Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F) prima dell'uso. L MPA coniugato con enzima (flacone con il tappo rosso) è fornito concentrato. Poiché l'enzima coniugato diluito ha una stabilità limitata, è bene ricostituire solo la quantità necessaria ad effettuare il dosaggio. Prima di pipettare l'enzima, agitarlo accuratamente. Ricostituire l'enzima coniugato diluendolo 1:11 (1+10) nel diluente (es. 200 µl di coniugato + 2 ml di diluente, pronto all uso e sufficiente per 4 strip). L'anticorpo anti-acetilgestagene (flacone con tappo nero) è fornito concentrato. Poiché l'anticorpo diluito ha una stabilità limitata, è bene ricostituire solo la quantità necessaria per il dosaggio. Prima di pipettare l'anticorpo, agitarlo accuratamente. Ricostituire l'anticorpo diluendolo 1:11 (1+10) con il diluente (es. 200 µl di anticorpo + 2 ml di diluente, pronto all uso e sufficiente per 4 strip). Come soluzione di lavaggio utilizzare acqua distillata con tween 20 allo 0,05% (es. 0,5 g di tween 20 in 1000 ml di acqua distillata). La soluzione deve essere preparata al momento del test. 8 RIDASCREEN Acetylgestagene

9 10.2. Procedura per l'esecuzione del test Eseguire scrupolosamente la procedura di lavaggio consigliata. Non lasciare asciugare i pozzetti tra i vari passaggi. 1. Inserire un numero sufficiente di pozzetti nel supporto per tutti gli standard e i campioni da eseguire in duplicato. Registrare le posizioni assegnate agli standard e ai campioni. 2. Pipettare 20 µl di standard o di campione preparato nei pozzetti corrispondenti e 50 µl di enzima coniugato diluito ad ogni pozzetto. 3. Pipettare 50 µl di anticorpo diluito in ogni pozzetto. Agitare delicatamente facendo oscillare la piastra manualmente ed incubare per 2 ore a temperatura ambiente (20-25 C / F). 4. Svuotare i pozzetti e picchiettare energicamente per almeno tre volte la piastra su carta assorbente in modo da eliminare tutto l eventuale liquido residuo. Riempire i pozzetti con 250 µl di soluzione di lavaggio (vedi par ) ed eliminare nuovamente il liquido ottenuto. Ripetere altre 2 volte.. 5. In ogni pozzetto pipettare 50 µl di substrato e 50 µl di cromogeno. Miscelare delicatamente agitando la piastra manualmente ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F) e al buio. 6. Pipettare 100 µl di soluzione di stop in ogni pozzetto. Miscelare delicatamente agitando la piastra manualmente e leggere le assorbanze a 450 nm contro aria. Leggere entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di stop. RIDASCREEN Acetylgestagene

10 11. Risultati Per la valutazione dei saggi immunoenzimatici RIDASCREEN è disponibile un apposito software, denominato RIDA SOFT Win/ RIDA SOFT Win.net (Cod. N. Z9996). Il profilo della curva degli standard è mostrato nel Quality Assurance Certificate allegato. Nota per il calcolo in assenza di software: Assorbanza dello standard (o campione) X 100 = % assorbanza Assorbanza standard zero Lo standard zero risulta pertanto essere il 100% e i valori di assorbanza sono espressi in percentuale. I valori calcolati per gli standard vanno inseriti in un sistema di coordinate su scala semilogaritmica contro la concentrazione equivalente di acetilgestageni in µg/kg. Per ottenere la concentrazione di acetilgestagene in µg/kg (ppb) effettivamente contenuta nel campione, la concentrazione calcolata dalla curva standard deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione corrispondente. Operando secondo le procedure descritte, il fattore di diluizione da applicare è il seguente: Tessuto adiposo perirenale bovino... 2 Ulteriori note applicative: - Preparazione del campione per MPA in mangimi (grano) - Preparazione del campioni per sciroppo Per ulteriori informazioni o note applicative contattare il proprio distributore locale. 10 RIDASCREEN Acetylgestagene

11 R-Biopharm non fornisce alcuna garanzia, esplicita o implicita, oltre a quella relativa alla qualità standard dei materiali di cui sono costituiti i suoi prodotti. Nel caso tali materiali risultassero difettosi, R-Biopharm si impegna a fornire prodotti sostitutivi. Non esiste garanzia di commerciabilità o di idoneità del prodotto per uno scopo particolare. R-Biopharm non è da ritenersi responsabile per danni, ivi compresi danni speciali o indiretti, o spese derivanti direttamente o indirettamente dall utilizzo del prodotto. RIDASCREEN Acetylgestagene