RIDASCREEN Trenbolon Art. Nr. R2601

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1 RIDASCREEN Trenbolon Art. Nr. R2601 Test immunoenzimatico per l analisi quantitativa di Trenbolone Test in vitro Conservare a 2-8 C

2 Prodotto da: R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße 17 D Darmstadt Per informazioni: Centralino: Telefono: +49 (0) Ufficio ordini: Fax: +49 (0) Marketing & Sales Telefono: +49 (0) Distribuito da: R-Biopharm Italia Srl Via Morandi, Melegnano MI Telefono RIDA e RIDASCREEN sono marchi registrati della R-BIOPHARM AG Produttore: R-BIOPHARM AG, Darmstadt, Germania R-BIOPHARM AG è certificata ISO RIDASCREEN Trenbolon

3 RIDASCREEN Trenbolon Introduzione RIDASCREEN Trenbolon (Art. No.: R2601) è un immunodosaggio enzimatico competitivo per l'analisi quantitativa del Trenbolone in campioni di urina, bile, carne, fegato e feci. Tutti i reagenti richiesti per il dosaggio immunoenzimatico - inclusi gli standard - sono contenuti nel kit. Il kit è sufficiente per 96 determinazioni (inclusi gli standard). Per la quantificazione è richiesto un lettore per micropiastre. Preparazione campioni: Tempo richiesto: Limite di rilevabilità: idrolisi purificazione cromatografica con colonne RIDA C18 (Art. No.: R2002) preparazione dei campioni (10 campioni)... ca. 4 h esecuzione del test (tempo d incubazione) h urine... ca. 400 ng/l (ppt) bile... ca. 1 µg/l (ppb) carne e fegato... ca. 200 ng/kg (ppt) feci ng/kg (ppt) Valore di recupero: in campioni di urina arricchiti... ca. 85 % ± 12 % La specificità di RIDASCREEN Trenbolon è stata determinata analizzando i valori di cross-reattività delle sostanze corrispondenti in un sistema tampone. Nei campioni la specificità può differire da quella determinata in un sistema tampone a causa dell effetto matrice. Prima dell analisi delle sostanze cross-reattive, è necessario determinare il limite di rilevabilità ed i valori di recupero delle sostanze nel rispettivo campione. Il test non è in grado di discriminare tra analita e sostanza cross-reattiva. Specificità: 17β-Trenbolone % Trendione % 17α-Trenbolone... ca. 82 % 17β-Trenbolone-glucuronide... ca. 82 % 17α-Trenbolone-glucuronide... ca. 7 % 19-Nortestosterone... ca % Testosterone, Estradiolo, Zeranolo, DES and Cloramfenicolo...< 0.01 % RIDASCREEN Trenbolon

4 Al fine di aumentare la qualità delle prestazioni durante l'esecuzione di procedure ELISA, si prega di far riferimento al nostro Good ELISA Practice (GEP) Manual, nella versione aggiornata. Qui si elencano gli standard minimi riguardanti le condizioni di lavoro quando si utilizzano i kit di R-Biopharm AG e si eseguono test ELISA. Il manuale può essere visionato, stampato e scaricato direttamente dal nostro sito Prodotti correlati: RIDA Trenbolon Spiking Solution... (R2699) Trenbolon Test Kontrolle (negativ)... (R2608) RIDASCREEN Methyltestosteron... (R3611) RIDA Methyltestosteron Spiking Solution... (R3699) RIDASCREEN 19-Nortestosteron... (R2801) RIDA 19-Nortestosteron Spiking Solution... (R2899) RIDASCREEN Ethinylöstradiol... (R2511) RIDA Ethinylöstradiol Spiking Solution... (R2599) 1. Scopo RIDASCREEN Trenbolon è un immunodosaggio enzimatico competitivo per l'analisi quantitativa di residui di Trenbolone in campioni di urina, bile, carne, fegato e feci. 2. Generale Il trenbolone acetato è uno steroide anabolizzante molto efficiente con una forte attività androgena. Se utilizzato in modo appropriato, i suoi residui non hanno evidenziato alcuna attività genotossica. Invece, se somministrato in alte concentrazioni, il trenbolone induce trasformazioni cellulari in test aventi per substrato cellule embrionali di criceto siriano e risulta leggermente positivo all Ames-test. 4 RIDASCREEN Trenbolon

5 3. Principio del test Il test si basa su una reazione antigene-anticorpo. I pozzetti della micropiastra sono coattati con anticorpi di cattura diretti contro anticorpi anti-trenbolone. Vi si aggiungono: le soluzioni standard o i campioni, il trenbolone coniugato con enzima e l anticorpo anti-trenbolone. Il trenbolone libero e il trenbolone coniugato con enzima competono per i siti di legame degli anticorpi (immunodosaggio enzimatico competitivo). Contemporaneamente gli anticorpi anti-trenbolone vengono legati dagli anticorpi di cattura immobilizzati in piastra. L'enzima coniugato non legato viene rimosso con il lavaggio. Successivamente vengono aggiunti ai pozzetti ed incubati il substrato enzimatico (urea-perossidasi) ed il cromogeno (tetrametilbenzidina). L'enzima coniugato legato converte il cromogeno in un prodotto azzurro. L'aggiunta dello stop porta al viraggio del colore dal blu al giallo. La misurazione fotometrica viene eseguita a 450 nm. L'assorbimento è inversamente proporzionale alla concentrazione di trenbolone nel campione. 4. Reagenti forniti Ogni kit contiene materiale sufficiente per 96 analisi (incluse le analisi degli standard). Ogni kit contiene: Componente Colore del tappo Formato Quantità Micropiastra - Pronto all uso 96 pozzetti Standard 1 Bianco Pronto all uso 0 ng/l 1.3 ml Standard 2 Bianco Pronto all uso 25 ng/l 1.3 ml Standard 3 Bianco Pronto all uso 50 ng/l 1.3 ml Standard 4 Bianco Pronto all uso 100 ng/l 1.3 ml Standard 5 Bianco Pronto all uso 200 ng/l 1.3 ml Standard 6 Bianco Pronto all uso 400 ng/l 1.3 ml Conjugate Rosso Concentrato 0.7 ml Antibody Nero Concentrato 0.7 ml Conjugate/antibody/sample buffer - Pronto all uso 25 ml Substrate Verde Pronto all uso 7 ml Chromogen Blu Pronto all uso 7 ml Stop solution Giallo Pronto all uso 14 ml RIDASCREEN Trenbolon

6 5. Materiale richiesto ma non fornito 5.1. Attrezzatura: lettore per micropiastre (450 nm) incubatore a 37 C (98 F) evaporatore ultra turrax pipette graduate micropipette da µl e µl a volume variabile RIDA C18 column (Art. No.: R2002) 5.2. Reagenti: metanolo p.a. tert. Butilmetiletere p.a. NaOH 1M acido fosforico 1M 54 mm Fe-III NH4 (SO4)2 glucuronidasi/arilsulfatasi di Helix pomatia (Merck Art. No.: 4114) sodio acetato 50 mm ph 4.8: 4.1 g di sodio acetato (CH 3 COONa), portare a 1 litro con acqua distillata, regolare il ph a 4.8 con acido acetico 20 % sodio acetato 500 mm ph 4.8: 41 g di sodio acetato (CH 3 COONa), portare a 1 litro con acqua distillata, regolare il ph a 4.8 con acido acetico 20 % tampone fosfato 20 mm ph : 0.55 g di NaH 2 PO 4 x H 2 O g di Na 2 HPO 4 x 2H 2 O + 9 g di NaCl, portare a 1 litro con acqua distillata tampone fosfato 67 mm ph : 1.8 g di NaH 2 PO 4 x H 2 O g di Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O + 9 g di NaCl, portare a 1 litro con acqua di 6. Avvertenze e precauzioni per gli utilizzatori Questo test dovrebbe essere effettuato solo da personale di laboratorio qualificato. Le istruzioni per l'uso devono essere rispettate rigorosamente. Il kit può contenere sostanze pericolose. Per ulteriori informazioni sulla sostanze contenute, far riferimento alla scheda di sicurezza (MSDS) scaricabile direttamente online al sito 6 RIDASCREEN Trenbolon

7 7. Conservazione Conservare il kit a 2-8 C (35-46 F). Non congelare alcun componente del kit. I pozzetti non utilizzati vanno riposti insieme all essiccante nella loro confezione originale, che deve essere ben richiusa e conservata a 2-8 C (35-46 F). Il cromogeno incolore è fotosensibile: evitarne l'esposizione alla luce diretta. Non si applica alcuna garanzia di qualità dopo la data di scadenza indicata sull etichetta del prodotto. Non scambiare singoli reagenti appartenenti a kit con diverso numero di lotto. 8. Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti Qualsiasi colorazione bluastra della soluzione substrato/cromogeno, prima dell esecuzione del test Valori inferiori a 0,6 unità di assorbanza (A 450nm < 0.6) per lo standard 1 9. Preparazione dei campioni 9.1. Urine diluire 0,5 ml di urina con 3 ml di soluzione 50 mm di sodio acetato (vedi paragrafo 5.2.) aggiungere 8 µl di glucuronidasi/arilsulfatasi di Helix pomatia (vedi par. 5.2.) idrolizzare, incubando la soluzione a 37 C (98 F) per 3 ore, o in alternativa a temperatura ambiente (20-25 C, F) per tutta la notte Purificare il prodotto idrolizzato con le RIDA C18 column (cod. R2002) secondo la seguente procedura (flusso: 1 goccia/secondo): sciacquare la colonna con 3 ml di metanolo (100%) equilibrare la colonna con 2 ml di tampone fosfato 20 mm (vedi par. 5.2.) applicare il campione (tutto il volume ottenuto dopo idrolisi o estrazione) sciacquare la colonna con 2 ml di metanolo (40%) eliminare tutto il liquido residuo dalla colonna applicando un flusso di aria o di azoto eluire lentamente con 1 ml di metanolo (80%) con un flusso di 15 gocce al minuto diluire l'eluato 1:2 (1+1) con acqua distillata nel test utilizzare 20 µl per ogni pozzetto RIDASCREEN Trenbolon

8 9.2. Bile diluire 0.05 ml di bile con 0.45 ml di soluzione 50 mm di sodio acetato (vedi paragrafo 5.2.) aggiungere 2 µl di glucuronidasi/arilsulfatasi di Helix pomatia (vedi par. 5.2.) idrolizzare, incubando la soluzione a 37 C (98 F) per 3 ore, o in alternativa a temperatura ambiente (20-25 C, F) per tutta la notte) Purificare il prodotto idrolizzato con le RIDA C18 column (cod. R 2002) come descritto al par Carne asportare il grasso e macinare il campione omogeneizzare 10 g di campione con 10 ml di tampone fosfato 67 mm (vedi par. 5.2.) con un ultra turrax e agitare per 5 minuti miscelare 2 g di campione omogeneizzato con 5 ml di tert. butilmetiletere in una provetta per centrifuga con tappo a vite. Agitare vigorosamente per minuti centrifugare per 10 minuti a 3000 g e a C (50-59 F) trasferire il surnatante in una nuova provetta con tappo a vite ripetere la procedura di estrazione con ulteriori 5 ml di tert. butilmetiletere combinare le due fasi eteriche e portarle a secco. Dissolvere il residuo secco in 1 ml di metanolo (80%) diluire la soluzione metanolica con 2 ml di soluzione fosfato 20 mm (vedi paragrafo 5.2.) Purificare il prodotto idrolizzato con le RIDA C18 column (cod. R 2002) come descritto al par Fegato omogeneizzare 1 g di fegato con 2 ml di sodio acetato 0.5 M (vedi par. 5.2.) aggiungere 8 µl di glucuronidasi/arilsulfatasi di Helix pomatia (vedi par. 5.2.) idrolizzare, incubando la soluzione a 37 C (98 F) per 3 ore, o in alternativa a temperatura ambiente (20-25 C, F) per tutta la notte Purificare il prodotto idrolizzato con le RIDA C18 column (cod. R 2002) come descritto al par RIDASCREEN Trenbolon

9 9.5. Feci omogeneizzare 2 g di feci con 6 ml di acqua distillata estrarre l'omogeneizzato con 6 ml di tert. butilmetiletere asciugare l'estratto, dissolverlo in 0,5 ml di metanolo (80%) e lavarlo con 2 ml di etere di petrolio combinare la soluzione metanolica con 1 ml di NaOH 1 M e aggiungere 0,7 ml di Fe-III NH4 (SO4)2 54 mm in acido fosforico 1M dopo 10 minuti centrifugare il precipitato per 10 minuti a 3000 g e a 0 C (32 F) Purificare il prodotto idrolizzato con le RIDA C18 column (cod. R 2002) come descritto al par Nota: I campioni originali possono essere conservati approssimativamente per 2 giorni a 2-8 C (35-46 F) e per diverse settimane a -20 C (-4 F). I campioni idrolizzati (urina, bile, fegato) e i campioni estratti di muscolo e feci possono essere conservati prima della purificazione con colonne RIDA C18 per 1 o 2 giorni a 2-8 C (35-46 F) e per più settimane a -20 C (-4 F). Gli eluati in metanolo 80% e 40% possono essere conservati sigillati per diversi mesi a -20 C (-4 F) oppure per due settimane in frigorifero. Evitare di congelare e scongelare le soluzioni frequentemente. Per concentrazioni maggiori di trenbolone si consiglia di diluire ulteriormente l estratto con soluzione di metanolo al 40%. RIDASCREEN Trenbolon

10 10. Esecuzione del test Indicazioni preliminari Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F) prima dell'uso. Il trenbolone coniugato con enzima (flacone con tappo rosso) è fornito concentrato. Poiché l'enzima coniugato ha una stabilità limitata, è bene ricostituire solo la quantità necessaria ad effettuare il dosaggio. Prima di pipettare l'enzima, agitarlo accuratamente. Ricostituire l'enzima coniugato diluendolo 1:11 (1+10) nel buffer (es. 200 µl di coniugato concentrato + 2 ml di buffer, sufficiente per 4 strip). L anticorpo anti-trenbolone (flacone con tappo nero) è fornito concentrato. Poiché l'anticorpo diluito ha una stabilità limitata, è consigliabile ricostituire solo la quantità necessaria per il dosaggio. Prima di pipettare l'anticorpo, agitarlo accuratamente. Ricostituire l'anticorpo diluendolo 1:11 (1+10) con il buffer (es. 200 µl di anticorpo concentrato + 2 ml di diluente, sufficiente per 4 strip) Procedura per l'esecuzione del test Eseguire attentamente la procedura di lavaggio raccomandata. Evitare l asciugamento dei pozzetti tra i vari passaggi del test. 1. Inserire un numero sufficiente di pozzetti nel supporto per tutti gli standard e i campioni da eseguire in duplicato. Registrare le posizioni assegnate agli standard e ai campioni. 2. Pipettare 20 µl di standard o campioni preparati nei pozzetti corrispondenti (due pozzetti per ogni campione o standard). Pipettare 50 µl di enzima coniugato diluito sul fondo di ogni pozzetto. 3. Pipettare 50 µl di anticorpo anti-trenbolone diluito in ogni pozzetto. Agitare delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F). 4. Eliminare il liquido dai pozzetti e picchiettare energicamente per 3 volte la piastra capovolta su carta assorbente per eliminare ogni residuo di liquido. Riempire i pozzetti con 250 µl di acqua distillata e svuotarli nuovamente. Ripetere l operazione di lavaggio altre due volte. 5. In ogni pozzetto pipettare 50 µl di substrato e 50 µl di cromogeno. Agitare delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F) e al buio. 6. Aggiungere 100 µl di soluzione di stop in ogni pozzetto. Agitare leggermente facendo oscillare manualmente la piastra e leggere le assorbanze a 450 nm, entro 30 minuti dall aggiunta dello stop. 10 RIDASCREEN Trenbolon

11 11. Risultati Per i test immunoenzimatici RIDASCREEN è disponibile un apposito software denominato RIDA SOFT Win.net (Art. No. Z9996). Il profilo della curva standard è rappresentato nel Certificato di Assicurazione della Qualità allegato al kit. Nota per il calcolo senza software: Assorbanza dello standard (o campione) X 100 = B/B 0 (%) Assorbanza standard zero Lo standard zero è così uguale al 100% e i valori di assorbanza sono calcolati in percentuale. Inserire i valori calcolati per gli standard in un sistema di coordinate su scala semilogaritmica contro le concentrazioni di trenbolone espresse in ng/kg. Per ottenere la concentrazione di trenbolone in ng/kg (ppt) effettivamente contenuta nel campione, moltiplicare il valore ricavato dalla curva di calibrazione per il corrispondente fattore di diluizione. Lavorando secondo le procedure descritte, i fattori di diluizione da applicare sono i seguenti: urine... 4 bile carne... 2 fegato... 2 feci... 1 Per ulteriori informazioni o note applicative contattare il proprio di distributore locale. Note applicative: - Preparazione dei campioni di plasma/siero bovino R-Biopharm non fornisce alcuna garanzia, esplicita o implicita, oltre a quella relativa alla qualità standard dei materiali di cui sono costituiti i suoi prodotti. Nel caso tali materiali risultassero difettosi, R-Biopharm si impegna a fornire prodotti sostitutivi. Non esiste garanzia di commerciabilità o di idoneità del prodotto per uno scopo particolare. R-Biopharm non è da ritenersi responsabile per danni, ivi compresi danni speciali o indiretti, o spese derivanti direttamente o indirettamente dall utilizzo del prodotto. RIDASCREEN Trenbolon