PLATELIA HSV 2 IgG 96 TEST 72821

Transcript

1 PLATELIA HSV 2 IgG 96 TEST DETERMINAZIONE QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI-HSV 2 NEL SIERO O NEL PLASMA UMANO MEDIANTE IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO

2 1. USO PREVISTO Platelia HSV 2 IgG è un immunodosaggio ELISA indiretto per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgG anti-herpes simplex tipo 2 nel siero o nel plasma umano. 2. INTERESSE CLINICO Il virus dell'herpes simplex (HSV) è un agente patogeno umano comune, presente in tutto il mondo. Si distinguono due sierotipi: l'hsv-1 e l'hsv-2. L'HSV-1 è principalmente associato alle infezioni della lingua, della bocca, delle labbra, della faringe e degli occhi; mentre l'hsv-2 alle infezioni genitali e neonatali. Tuttavia entrambi i virus possono causare infezioni genitali e sempre più spesso l'hsv-1 viene riconosciuto come possibile causa dei sintomi genitali. L'HSV viene trasmesso mediante contatto diretto con le secrezioni di una persona infetta, sintomatica o asintomatica. La maggior parte delle infezioni genitali viene trasmessa in assenza di sintomi. L'infezione primaria da HSV può avvenire a qualsiasi età e colpisce indistintamente neonati, bambini e adulti. Dopo l'infezione primaria, l'hsv colonizza i neuroni sensoriali e l'infezione latente può riattivarsi causando un'infezione clinica ricorrente. Le donne che contraggono il virus HSV tipo-1 o tipo-2 durante la gravidanza possono trasmettere il virus al bambino prima o durante il parto. Le infezioni in utero possono causare aborti spontanei o parti prematuri. Il rischio maggiore di infezione neonatale interessa i bambini la cui madre abbia contratto l'infezione genitale durante l'ultimo trimestre di gravidanza. Le infezioni congenite e neonatali possono essere causate da un'infezione primaria o ricorrente, sintomatica o asintomatica della madre, e possono causare infezioni della pelle, degli occhi o della bocca, ma anche danni al sistema nervoso centrale nel neonato. Nelle infezioni primarie da HSV, gli anticorpi IgM compaiono generalmente fra il terzo e il settimo giorno dopo la manifestazione dei sintomi. Il titolo di anticorpi IgM aumenta nelle successive quattro - sei settimane per poi tornare generalmente a livelli non rilevabili dopo due mesi. Talvolta è possibile rilevare anticorpi IgM anti-hsv nelle infezioni ricorrenti. Tuttavia, la produzione e determinazione degli anticorpi IgM anti-hsv nei pazienti con infezioni ricorrenti è meno prevedibile e può essere correlata alla gravità dell'infezione stessa. Gli anticorpi IgG anti-hsv generalmente compaiono a distanza di una o due settimane dalla manifestazione dell'infezione e persistono a vari livelli per tutta la vita. 68

3 Per determinare gli anticorpi anti-hsv sono stati sviluppati numerosi metodi sierologici, fra i quali la fissazione del complemento, l'immunofluorescenza indiretta, la neutralizzazione su placca e il test ELISA. Rispetto ad altri test sierologici, la tecnica ELISA può fornire un elevato livello di specificità, sensibilità e affidabilità nella determinazione degli anticorpi anti-hsv. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sierologici che consentono di stabilire lo stato immunitario nei confronti del virus HSV, utilizza lisati virali come antigene. A causa delle significativa reattività crociata esistente fra i virus HSV-1 e HSV-2 e della schiacciante prevalenza di infezioni da HSV-1, è praticamente impossibile differenziare in modo affidabile le infezioni HSV-1 da quelle HSV-2 con questi test (2). Recentemente sono stati sviluppati test sierologici HSV tipo-specifico basandosi sulla significativa differenza esistente fra la proteina gg-1 dell'hsv-1 e la proteina gg-2 dell'hsv-2 (2) Il kit Platelia TM HSV 2 IgG utilizza un frammento peptidico sintetico della glicoproteina gg-2 immobilizzato su micropozzetti al fine di garantire una migliore specificità e un'accurata distinzione fra l'infezione da HSV 1 e quella da HSV PRINCIPIO Platelia HSV 2 IgG è un test qualitativo per la determinazione degli anticorpi IgG anti-hsv 2 nel siero o nel plasma umano mediante un metodo immunoenzimatico ELISA indiretto. I frammenti sintetici della glicoproteina gg-2 vengono utilizzati per sensibilizzare la micropiastra. Come coniugato viene utilizzato un anticorpo policlonale marcato con perossidasi specifico per le catene gamma umane (anti-igg). Il test prevede le seguenti fasi: Fase 1 I campioni dei pazienti e i controlli vengono diluiti in rapporto 1/21, quindi distribuiti nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37 C, gli anticorpi IgG anti-hsv 2 presenti nel campione si legano al frammento peptidico sintetico della glicoproteina gg-2 adeso ai pozzetti della micropiastra. Gli anticorpi non specifici non legati e altre proteine seriche vengono eliminati dai lavaggi successivi all'incubazione. Fase 2 Il coniugato (anticorpo polyclonale marcato con perossidasi specifico per le catene gamma umane) viene aggiunto nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37 C, l'anticorpo monoclonale marcato si lega al siero IgG catturato dal frammento della glicoproteina gg 2. Il coniugato non legato viene eliminato dai lavaggi successivi all'incubazione. 69

4 Fase 3 La presenza di immunocomplessi (frammento della glicoproteina gg-2, anticorpi IgG anti-hsv 2, coniugato anti-igg) viene dimostrata attraverso l'aggiunta di una soluzione di sviluppo enzimatica in ogni pozzetto. Fase 4 Al termine del periodo di incubazione a temperatura ambiente ( C), la reazione enzimatica viene bloccata attraverso l'aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N. La lettura della densità ottica ottenuta con uno spettrofotometro impostato su 450/620 nm è proporzionale alla quantità di anticorpi IgG anti-hsv 2 presenti nel campione. 4. INFORMAZIONI SUL PRODOTTO Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l'esecuzione di 96 test. Tutti i reagenti sono destinati all'uso esclusivo nella diagnostica in vitro. Marcatura Natura dei reagenti Presentazione R1 Microplate Micropiastra (Pronta per l'uso): 12 strip con 8 pozzetti divisibili, sensibilizzati con frammento sintetico di glicoproteina gg-2 1 R2 R3 Concentrated Soluzione di lavaggio concentrata (20x): Washing Tampone TRIS-NaCl (ph 7,4), Solution (20x) 2 % Tween 20 Conservante: < 1,5% ProClin 300 Negative Control Controllo negativo: Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-hsv 2 e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin 300 R4 Calibrator Calibratore: Siero umano reattivo per anticorpi IgG anti-hsv 2 e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin 300 R5 Positive Control Controllo positivo: Siero umano reattivo per anticorpi IgG anti- HSV 2 e negativo per antigene HBs, anti- HIV1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 70

5 Marcatura Natura dei reagenti Presentazione R6 Conjugate Coniugato (51x): Anticorpo policlonale di 1 x 0,7 ml (51x) capra anti-catene gamma umane unito a perossidasi di rafano Conservante: < 1,5% ProClin 300 R7 Diluent Diluente per campioni e coniugato (Pronto per l'uso): Tris-NaCl (ph 7,7), siero di vitello fetale, rosso fenolo Conservante: < 1,5% ProClin x 80 ml R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution Cromogeno (Pronto per l'uso): 1 x 28 ml tetramethylbenzidine (< 0.1%), H 2 O 2 (<1%) Soluzione bloccante (Pronta per l'uso): 1 x 28 ml Soluzione di acido solforico 1N Pellicola adesiva per micropiastre 4 Per informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di scadenza, consultare le indicazioni riportate sulla confezione. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle buone prassi di laboratorio riportate di seguito: Non utilizzare reagenti scaduti. Non mischiare, né combinare reagenti provenienti da lotti diversi in uno stesso ciclo. OSSERVAZIONE: per la soluzione di lavaggio (R2, identificativo etichetta: 20x color verde), il Cromogeno (R9, identificativo etichetta: TMB color turchese) e la soluzione bloccante (R10, identificativo etichetta: 1N color rosso) è possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, a condizione che i reagenti siano strettamente equivalenti e venga utilizzato un unico lotto in una stessa seduta analitica. OSSERVAZIONE: Inoltre, la Soluzione di Lavaggio (R2, identificazione dell etichetta : 20X di colore verde ) può essere miscelata con le altre 2 soluzioni di lavaggio incluse in vari kit di reattivi Bio-Rad (R2, identificazioni delle etichette : 10x di colore blu o 10x di colore arancione) una volta adeguatamente ricostituite, a condizione che all interno di una seduta analitica venga utilizzata solo una miscela. 71

6 Prima dell'uso, attendere circa 30 minuti per consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente (18-30 C). Ricostituire o diluire con cura i reagenti evitando contaminazioni. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e di aldeide) o polvere potenzialmente in grado di alterare l'attività enzimatica del coniugato. Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure elementi in vetro perfettamente lavati ed asciugati con acqua deionizzata. Il lavaggio della micropiastra è una fase essenziale della procedura: eseguire il numero di cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Un lavaggio inadeguato può condurre a risultati inesatti. Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo di tempo compreso fra la fine dell'operazione di lavaggio e la distribuzione del reagente. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo. La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino in contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o il cromogeno. La soluzione di cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione blu indica che il reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà essere sostituito. Utilizzare puntali diversi per ogni campione. Verificare l'accuratezza delle pipette e il buon funzionamento delle altre strumentazioni. ISTRUZIONI DI SICUREZZA E IGIENE Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione dei reagenti è stato analizzato e classificato non reattivo per l'antigene di superficie dell'epatite B (HBs Ag), gli anticorpi per il virus dell'epatite C (anti-hcv) e il virus dell'immunodeficienza umana (anti-hiv1 e anti-hiv2). Dato che nessun metodo può garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi, manipolare i reagenti di origine umana e i campioni dei pazienti come potenzialmente infetti. Qualsiasi materiale, comprese le soluzioni di lavaggio, che entri direttamente in contatto con campioni e reagenti contenenti materiali di origine umana deve essere considerato potenzialmente in grado di trasmettere malattie infettive. Indossare guanti monouso durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti. Non pipettare con la bocca. 72

7 Evitare di rovesciare campioni o soluzioni contenenti campioni. Pulire le superfici contaminate con candeggina diluita al 10%. Se il liquido contaminante è un acido, neutralizzare le superfici con bicarbonato di sodio, quindi pulire con candeggina diluita al 10% e asciugare con carta assorbente. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere gettato in un contenitore speciale per rifiuti contaminati. Dopo la decontaminazione, eliminare i campioni dei pazienti, i reagenti contenenti materiale di origine umana, compreso il materiale e i prodotti contaminati mediante uno dei seguenti metodi: - immersione nella candeggina alla concentrazione finale di 5% di ipocloruro di sodio per 30 minuti, - oppure lavaggio in autoclave a 121 C per almeno 2 ore. ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti ipocloruro di sodio nell'autoclave Evitare qualsiasi contatto del Cromogeno e della Soluzione bloccante con la pelle e le mucose (rischi di tossicità, irritazione o ustioni). La manipolazione e l'eliminazione dei residui chimici e biologici devono essere eseguite attenendosi alle buone prassi di laboratorio. Tutti i reagenti forniti nel kit sono destinati all'uso esclusivo nella diagnostica in vitro. Attenzione: alcuni reagenti contengono Proclin TM 300 < 1,5% R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle S28-37: In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua e sapone. Xi - Irritante Indossare guanti adatti 6. PRELIEVO, PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 1. Il siero e il plasma (EDTA, eparina o citrato) sono i tipi di campione raccomandati. 2. Per la manipolazione, l'elaborazione e la conservazione dei campioni ematici, attenersi alle seguenti raccomandazioni: Prelevare tutti i campioni di sangue secondo le precauzioni in uso. Per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima di procedere alla centrifugazione. Assicurarsi che le provette siano sempre chiuse. Dopo la centrifugazione, separare il siero o il plasma dal coagulo o dai globuli rossi e conservarlo in una provetta chiusa ermeticamente. È possibile conservare i campioni a una temperatura compresa fra +2 e 8 C a condizione che il test venga eseguito entro 7 giorni. 73

8 Se il test non viene eseguito entro 7 giorni, o per motivi di consegna, congelare i campioni a una temperatura di -20 C o inferiore. Non utilizzare campioni scongelati più di cinque volte. I campioni precedentemente congelati devono essere miscelati bene (Vortex) dopo lo scongelamento e prima del test. 3. I campioni contenenti 90 g/l di albumina o 100 mg/l di bilirubina non coniugata, campioni lipemici contenenti l'equivalente di 36 g/l di trioleina (trigliceride) e i campioni sottoposti ad emolisi contenenti fino a 10 g/l di emoglobina non influenzano i risultati. 4. Non riscaldare i campioni. 7. PROCEDURA 7.1 MATERIALE RICHIESTO, MA NON FORNITO Agitatore tipo Vortex. Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 nm e 620 nm (*). Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su 37±1 C (*). Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per micropiastre (*). Acqua distillata o deionizzata sterile. Guanti monouso. Occhiali di sicurezza o antispruzzo. Carta assorbente. Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o preimpostate per misurare e dispensare da 10 µl a µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml. Cilindri graduati con capacità di 25 ml, 50 ml, 100 ml e ml. Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio. Contenitore per rifiuti biologici. Provette monouso. (*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata, consultare il nostro reparto tecnico. 7.2 RICOSTITUZIONE DEI REAGENTI R1: Prima di aprire la bustina di plastica, lasciare 30 minuti a temperatura ambiente (18-30 C). Estrarre il vassoio, riporre immediatamente le strip non utilizzate nella bustina e verificare la presenza di essiccante. Richiudere con cura la bustina e conservarla a 2-8 C. 74

9 R2: Diluire in rapporto 1/20 la soluzione di lavaggio R2 in acqua distillata: ad esempio 50 ml di R2 e 950 ml di acqua distillata per ottenere la soluzione di lavaggio pronta per l'uso. Preparare 350 ml di soluzione di lavaggio diluita per una piastra da 12 strip in caso di lavaggio manuale. R3, R4, R5: Diluire in rapporto 1/21 nel Diluente (R7) (esempio: 15 µl di R µl di R7). R6+R7: Il coniugato (R6) è concentrato 51x e deve essere omogeneizzato prima dell'uso. Diluire in rapporto 1/51 nel Diluente (R7). Per una piastra, diluire 0,5 ml di Coniugato (R6) in 25 ml di Diluente (R7). Per ottenere il volume necessario per due strip, dividere i suddetti volumi per CONSERVAZIONE E VALIDITÀ DEI REAGENTI APERTI E / O RICOSTITUITI Il kit deve essere conservato a 2-8 C. Se viene conservato a 2-8 C prima dell'apertura, ogni componente può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta riportata sul kit. R1: Dopo l'apertura, le strip mantengono la stabilità fino a 8 settimane, se conservate a 2-8 C nella stessa bustina sigillata (verificare la presenza di essiccante). R2: Dopo la diluizione, la Soluzione di lavaggio può essere conservata per 2 settimane a 2-30 C. La Soluzione di lavaggio concentrata conservata a 2-30 C, in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. R3, R4, R5, R6, R7: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a +2-8 C mantengono la stabilità fino a 8 settimane. R6+R7: Dopo la diluizione, la soluzione di lavoro del coniugato mantiene la stabilità per 8 ore a temperatura ambiente (18-30 C) oppure per 24 ore a 2-8 C. R9: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a 2-8 C mantengono la stabilità fino a 8 settimane. R10: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, il reagente conservato a 2-8 C mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. 7.4 PROCEDURA Seguire attentamente la procedura descritta di seguito e le buone prassi di laboratorio. Prima dell'uso, consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente (18-30 C). 75

10 Se si utilizzano pozzetti divisibili, prestare particolare attenzione durante la manipolazione. Utilizzare i controlli negativi, positivi e di cut-off in ogni ciclo per convalidare i risultati del test. 1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione per i controlli e i campioni dei pazienti. 2. Preparare la Soluzione di lavaggio diluita (R2) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 3. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall'involucro protettivo [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 4. Diluire i controlli R3 ed R5, il calibratore R4 e i campioni dei pazienti (S1, S2 ) nel Diluente (R7) per ottenere una diluizione in rapporto 1/21: 15 µl di campione e 300 µl di Diluente (R7). Vortexare i campioni diluiti. 5. Distribuire in ogni pozzetto 200 µl di controlli diluiti, del calibratore e di campioni dei pazienti secondo lo schema riportato di seguito: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Ricoprire la micropiastra con la pellicola adesiva ed esercitare pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra a bagnomaria termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. 7. Al termine del primo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillante adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 5 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. 8. Preparare la soluzione di lavoro del coniugato (R6+R7) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. Distribuire immediatamente 200 µl della soluzione di lavoro del coniugato (R6+R7) in tutti i pozzetti. Agitare leggermente la soluzione prima dell'uso. 76

11 9. Ricoprire la micropiastra con la pellicola adesiva ed esercitare pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra a bagnomaria termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. 10. Al termine del secondo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillante adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 5 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. 11. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto e al riparo dalla luce 200 µl di Cromogeno (R9). Far sviluppare la reazione al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente ( C). Non utilizzare nastri sigillanti adesivi durante questo periodo di incubazione. 12. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µl di Soluzione bloccante (R10) in ogni pozzetto. Utilizzare la stessa sequenza e lo stesso ritmo di distribuzione utilizzati per la soluzione di sviluppo. 13. Asciugare accuratamente il fondo della piastra. Leggere la densità ottica a 450/620 nm mediante un lettore nei 30 minuti successivi alla reazione. Non esporre le strip alla luce prima della lettura. 14. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la lettura e il piano di distribuzione delle piastre e dei campioni. 8. CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 8.1 CALCOLO DEL VALORE SOGLIA (CUT-OFF) (CO) Il valore di Cut-Off (CO) corrisponde al valore medio delle densità ottiche (DO) dei duplicati del calibratore (R4): CO = media di DO R4 8.2 CALCOLO DEL RAPPORTO CAMPIONE Il risultato per un campione viene espresso sotto forma di rapporto mediante la seguente formula: Rapporto Campione = DO campione/co 8.3 CONTROLLO DI QUALITA Analizzare i risultati ottenuti da tutti i controlli per ogni micropiastra e per ogni ciclo. Per la convalida del test, è necessario soddisfare i seguenti criteri: Valori delle densità ottiche: - CO 0,300-0,80 x CO < DO R4 Duplicato 1 < 1,20 x CO 77

12 - 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 2 < 1,20 x CO (La singola DO di ogni duplicato del calibratore (R4) non deve differire più del 20% dal valore CO). Rapporti delle densità ottiche: - Rapporto R3 (DO R3 / CO) 0,50 - Rapporto R5 (DO R5 / CO) 1,80 Se non vengono rispettati i criteri del controllo di qualità, la seduta analitica dovrà essere ripetuta. 8.4 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Rapporto campione Risultato Interpretazione Rapporto < 0,90 Negativo Il campione è considerato non reattivo per la presenza di anticorpi IgG anti-hsv 2. 0,90 Rapporto < 1,10 Equivoco Il campione è considerato equivoco per la presenza di anticorpi IgG anti-hsv 2. Il risultato deve essere confermato da un altro test eseguito su un secondo campione prelevato ad almeno 4-12 settimane di distanza dalla data della prima analisi. Rapporto 1,10 Positivo Il campione è considerato reattivo per la presenza di anticorpi IgG anti-hsv 2. In caso di sospetta infezione, potrebbe essere utile condurre ulteriori test sierologici, come la determinazione degli anticorpi IgM anti-hsv, per confermare la diagnosi. In caso di risultati vicini alla zona grigia si deve prestare una attenzione particolare agli altri elementi del processo diagnostico. 8.5 GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI Le reazioni non convalidate o non ripetibili spesso sono causate da: Lavaggi della micropiastra inadeguati. Contaminazione dei campioni negativi tramite siero o plasma con alto titolo di anticorpi. Contaminazione della soluzione di sviluppo tramite agenti chimici ossidanti (candeggina, ioni metallici...). Contaminazione della Soluzione bloccante. 9. EFFICACIA Il kit Platelia HSV 2 IgG è stato valutato su 2 siti diversi su un totale di 751 campioni freschi o congelati. I risultati ottenuti con Platelia HSV 2 IgG sono stati confrontati con i risultati ottenuti con altri test EIA disponibili in commercio. 78

13 9.1 PREVALENZA Al fine di determinare la prevalenza degli anticorpi IgG anti-herpes simplex tipo 2 nel siero umano, sono stati analizzati 180 campioni di sangue di donne in gravidanza. I risultati ottenuti sono stati i seguenti: 155 sieri negativi e 25 positivi. La prevalenza determinata mediante il test Platelia HSV 2 IgG si attesta intorno al 13,9% (25/180). 9.2 SPECIFICITÀ La specificità è stata determinata su un totale di 558 campioni: Sul sito 1, un panel di 312 campioni di donatori di sangue, donne in gravidanza e panel commerciali (CDC (A) /BBI (B) ). Sul sito 2, un panel di 247 campioni di pazienti ricoverati. Su entrambi i siti, i campioni sono stati selezionati sulla base dei risultati negativi ottenuti con il test EIA disponibile in commercio e considerato lo standard di riferimento. Panel di campioni Negativo Equivoco (1) Positivo Specificità Sito 1 N = Sito 2 N = Totale N = ,4% (305/310) [96,3%-99,5%] 95,1% (231/243) [91,5%-97,4%] 96,9% (536/553) [95,1%-98,2%] (1) I risultati equivoci sono stati esclusi dal calcolo della specificità. IC 95%: intervallo di confidenza 95%. (A): Center for Disease Control, (B) BBI panel HSV con titoli diversi 9.3 SENSIBILITÀ La sensibilità è stata determinata su un totale di 172 campioni: Sul sito 1, un panel di 135 campioni di donatori di sangue, donne in gravidanza e panel commerciali (CDC (A) /BBI (B) ). Sul sito 2, un panel di 57 campioni di pazienti ricoverati. Su entrambi i siti, i campioni sono stati selezionati sulla base dei risultati positivi ottenuti con il test EIA disponibile in commercio e considerato lo standard di riferimento. 79

14 Panel di campioni Negative Negativo (1) Positivo Sensibilità Sito 1 N = Sito 2 N = Totale N = ,2% (131/132) [95,8%-100%] 100% (57/57) [94,9%-100%] 99,5% (188/189) [97,1%-100%] (1) I risultati equivoci sono stati esclusi dal calcolo della sensibilità. 9.4 PRECISIONE Precisione intra-saggio (ripetibilità): Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, un campione negativo, un campione equivoco e un campione positivo sono stati analizzati 30 volte durante lo stesso ciclo. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei tre campioni: N=30 Campione negativo Campione equivoco Campione debolmente positivo Rapporto (DO campione / Valore di cut-off) Media 0,82 0,97 1,30 DS 0,08 0,10 0,09 % CV 9,99% 9,87% 7,26% Precisione inter-saggio (riproducibilità): Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, un campione negativo e tre campioni positivi (uno debolmente, uno mediamente e uno fortemente positivo) sono stati analizzati in duplicato in due cicli al giorno per un periodo di oltre 20 giorni. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei quattro campioni: 80

15 N=80 Campione negativo Campione debolmente positivo Campione mediamente positivo Campione fortemente positivo Rapporto (DO campione / Valore di cut-off) Media 0,17 1,56 2,74 3,44 DS 0,02 0,16 0,33 0,38 % CV 13,1% 10.2% 11,9% 11,0% 9.5 REATTIVITÀ CROCIATA 105 campioni con caratteristiche tali da determinare reazioni non specifiche sono stati analizzati con il test Platelia HSV 2 IgG. I risultati ottenuti vengono riportati nella seguente tabella: Panel Numero di campioni Equivoco (1) Positivo Conferma risultati positivi mediante sierologia di riferimento VZV /2 CMV /3 EBV /1 Fattore reumatoide /4 Anticorpi eterofili (HAMA) Anticorpi antinucleo (ANA) / /2 HHV /2 81

16 Panel Numero di campioni Equivoco (1) Positivo Conferma risultati positivi mediante sierologia di riferimento HIV /8 Parotite epidemica /2 Morbillo /1 TOTALE /27 (1) I risultati equivoci sono stati esclusi dalla valutazione della reattività crociata. Tutti i risultati positivi al test Platelia HSV 2 IgG sono stati confermati dal test EIA disponibile in commercio. 10. LIMITI DELLA PROCEDURA La diagnosi dell'infezione da HSV può essere stabilita solamente sulla base di una combinazione di dati clinici e biologici. Il risultato di un singolo test di ricerca degli anticorpi IgG anti-hsv non costituisce una prova sufficiente per la diagnosi dell'infezione da Herpes simplex virus. 11. CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è conservata presso Bio-Rad. 82

17 8 REFERENCES 1. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines MMWR 2002:51 (No. RR-6). 2. Arvin, A, C Prober. Herpes Simplex Viruses In Murray, P, E Baron, M Pfaller, F Tenover, and R Yolkenet (eds.). Manual of Clinical Microbiology. 6th Ed. ASM, Washington, D.C. (1995) 1 / 1

18 133

19 134

20 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2008 Fax.: +33 (0) code: