Mercodia Ultrasensitive C-peptide ELISA

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1 Mercodia Ultrasensitive C-peptide ELISA Instruzioni per l uso REAGENTI PER 96 RILEVAZIONI Per l uso diagnostico in vitro Prodotto da Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A, SE Uppsala, Svezia

2 SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE/ Reagenti per 96 rilevazioni = 96 Data di scadenza Conservare tra i 2 8 Lotto n. Per l uso diagnostico in vitro Mercodia

3 USO PROPOSTO Mercodia Ultrasensitive C-peptide ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa della C-peptide umana nel siero, plasma ed urine. RELAZIONE La valutazione quantitativa e qualitativa della funzione della cellula ß pancreatica, non è solo in uso negli studi pre e post diagnostici della storia naturale del diabete melito, ma è anche rilevante nella pratica clinica come una guida per la corretta scelta del trattamento. I livelli periferici dell insulina non possono essere usati per valutare la funzione della cellula ß a causa di un condotto largo e variabile dalla circolazione portale verso il fegato, e perché i dosaggi dell insulina non possono distinguere tra endogena e insulina esogena. All interno delle cellule ß pancreatiche, la proinsulina si scinde in una molecola di C-peptide e una molecola d insulina. La C-peptide è ulteriormente compresa nella circolazione in una concentrazione equimolare a quelle dell insulina. In antitesi all insulina, la C-peptide è solo minimamente estratta dal fegato. Le concentrazioni periferiche di C-peptide riflettono perciò la secrezione di cellule ß più precisamente dell insulina. L escrezione urinaria di C-peptide è correlata con i livelli integrati di plasma di C-peptide ma l estrazione è altamente variabile tra e all interno individuali è quindi una misurazione imprecisa d ella funzione della cellula ß. PRINCIPIO DI PROCEDURA Mercodia Ultrasensitive C-peptide ELISA, è una fase concreta dell immunoanalisi Enzyme duesito. E basata sulla tecnica diretta sandwich nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro determinanti antigenici separati sulla molecola C-peptide. Durante l incubazione la C-peptide nella reazione del campione con anticorpi anti C-peptide diretto microtitrazione nei pozzetti. Dopo il lavaggio, gli anticorpi perossidasi coniugata sono aggiunti e dopo la seconda incubazione e un semplice lavaggio che rimuove indirettamente gli anticorpi degli enzimi marcati, il diretto Conjugate è scoperto dalla reazione con 3,3,5,5 tetrametibenzidine (TMB). La reazione è fermata aggiungendo acido per dare una posizione estrema clorimetrica che è letta spettrometricamente. PREACAUZIONI E AVVISI Per l uso diagnostico in vitro. I contenuti di questo kit e i suoi residui non devono essere ammessi al contatto con animali ruminanti o suini. La Stop Solution in questo kit contiene 0.5 M H 2 SO 4. Seguire le precauzioni quotidiane di routine per maneggiare sostanze chimiche pericolose. Tutti presi come campione potrebbero essere trattati come capaci di trasmettere infezioni. 3

4 MATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI Pipette con volumi adeguati (riutilizza le pipette in dotazione per l aggiunta della Assay Buffer, soluzione enzima coniugato 1X, Substrate TMB e Stop Solution) Provette, becher e cilindri per la preparazione di reagenti Acqua ridistillata Agitatore magnetico Miscelatore di vortice Lettore micro piastra (450 nm filtro) Piastra dello shaker ( giri/minuto, movimiento orbital) Micro piastra piano di lavaggio con la funzione traboccare-lavare (consigliato ma non obbligatorio) REAGENTI Ogni kit Mercodia Ultrasensitive C- peptide ELISA ( ) contiente reagenti per 96 prove, sufficienti per 42 campioni e una calibratura curva in duplicato. Per diverse serie di analisi, usare reagenti provenienti da scatole portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è stabilita sull etichetta all esterno. Si racommanda di conservare ad una temperatura di 2-8 C. Coated Plate 1 piastra 96 pozzetti Pronti per l uso topo monoclonale anti-c-peptide 8 strips de pozzetti Per le strisce di microtitolazione non utilizzati, sigillare nuovamente la confezione con nastro adesivo e conservare a 2 8 C per otto settimane. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fiale 1000 μl Liofilizzato C-peptide umano Aggiungere 1000 μl Giallo colore codificato acqua ridistilata Concentrazione ha affermato sull etichetta della fiala per fiala Conservare dopo la ricostituzione: 2-8 C per 1 settimana. Per la conservazione del Calibrator ricostituito per periodi superiori ad 1 settimana, conservare a 20 C. Calibrator 0 1 fiala 5 ml Pronti per l uso Giallo colore codificato Assay Buffer 1 fiala 6 ml Pronti per l uso Rosso colore codificato Enzyme Conjugate11X 1 fiala 1.2 ml Per la preparazione Peroxidasi Conjugate topo monoclonale anti-c-pepdide vedi sotto Enzyme Conjugate Buffer 1 fiala 12 ml Pronti per l uso Blu colore codificato Wash Buffer 21X 1 bottiglia 50 ml Diluir con 1000 ml Conservazione dopo la diluizione: d aqua ridistillata 2-8 C per 8 settimane per fare diluenti la soluzione de wash buffer 1X. Substrate TMB 1 bottiglia 22 ml Pronti per l uso Solución incolore Nota! Sensibile alla luce! 4

5 Preparazione della soluzione enzyme conjugate 1X Preparare la quantitá necessaria della enzyme conjugate 1X con la diluizione dell Enzyme Conjugate 11X, (1+10) nel Enzyme Conjugate Buffer in base alla tabella sottostante. Quando si prepara la soluzione enzyme conjugate 1X per tutta la piastra, versare tutto il tampone Enzyme Conjugate Buffer nella fiala dell Enzyme Conjugate 11X. Mescolare lievemente. Usare entro un giorno. Numero de strisce 12 strisce 8 strisce 4 strisce Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 700 μl 350 μl Enzyme Conjugate Buffer 1 fiala 7.0 ml 3.5 ml LA RACCOLTA E IL TRATTAMENTO DEL MODELLO Il siero Il prelievo in vena di sangue, permette di coagulare, e separare il siero con la centrifugazione. I campioni possono essere conservati a 2 8 C fino a 3 giorno. Per periodo più lunghi, conservare i campioni a 20 C. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento. Plasma Prelevare il sangue direttamente in vena in provette contenenti eparina o EDTA come anticoagulante, e separare la frazione del plasma. I campioni possono essere conservati a 2 8 C fino a 3 giorno. Per periodi più lunghi conservare i campioni a 20 C. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento. L urina Raccogliere l urina di 24 ore (senza conservativo). Tenere il campione a 2 8 C tra le raccolte. Registra la quantità totale del campione e ritenere un frazionato ben miscelato per le analisi. Conservare i campioni a 2 8 C per un massimo di 24 ore prima dell analisi. Per periodi più lunghi di conservazione, tenere i campioni di urina congelati a 70 C fino ad analisi effettuata. Devono essere evitati ripetuti congelamenti e scongelamenti. Frammenti cellulari dovrebbero essere rimossi prima dell analisi, sia tramite filtrazione o centrifugazione. Preparazione dei campioni L Urina. Diluire i campioni di urina 1/10 v/v nel Calibratore 0 prima dell analisi. 5

6 PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓN Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell uso. Preparar una calibratura curva per serie di analisi. 1. Preparar di soluzione enzyme conjugate 1X y di soluzione wash buffer 1X. 2. Preparare sufficienti pozzetti nelle micropiastre a comporre Calibrators, controlli e campioni in duplice copia. 3. Pipette 25 μl per ogni Calibrators, controlli e campioni in appropriati pozzetti. 4. Aggiungere 50 μl al Assay Buffer per ogni pozzetto. 5. Mettere in incubatrice in una piastra shaker ( rpm) per un ora a temperatura ambiente (18 25 C). 6. Lavare 6 volte con 700 μl di soluzione wash buffer 1X per pozzetto usando un lavatore automatico per piastre con la funzione traboccare-lavare. Dopo il lavaggio finale, capovolgere la piastra e picchiettarla con decisione contro della carta assorbente. Nella procedura di lavaggio non utilizzare la funzione immersione. O manualmente, Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo. Aggiungere 350 μl di soluzione wash buffer 1X ad ogni pozzetto. Eliminare la soluzione wash buffer 1X, sbattere con forza diverse volte contro carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. Ripetere 5 volte. Evitare prolungate pause di immersione durante la procedura di lavaggio. 7. Aggiungere 100 μl di soluzione enzyme conjugate 1X per ogni pozzetto. 8. Mettere in incubatrice in una piastra shaker ( rpm) per 1 ora a temperatura ambiente (18 25 C). 9. Lavare come descritto in Aggiungere 200 μl Substrate TMB. 11. Mettere in incubatrice per 30 minuti a temperatura ambiente (18 25 C). 12. Aggiungere 50 μl di Stop Solution ad ogni pozzetto. Mettere la piastra in uno shaker per approssimativamente per 5 secondi per garantire la miscelazione. 13. Leggere l assorbività a 450 mn e calcolare i risultati. Leggere entro 30 minuti. Nota! Per evitare qualsiasi contaminazione tra coniugato e substrato devono essere usate pipette distinte. 6

7 CONTROLLO DI QUALITA INTERNO I controlli commerciali e/o il siero interno proveniente da diversi donatori con basse, intermedie e alte concentrazioni di C-peptide dovrebbero essere analizzate periodicamente come se fossero esterne, e i risultati tracciati di giorno in giorno. E buona norma di un laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi: un certo numero di kit, date di preparazione dei componenti del kit, i valori di OD per il modulo, Calibrators e controlli. I laboratori dovrebbero seguire le norme governative o i requisiti di accreditamento per la frequenza dei controlli di qualità. IL CALCOLO DEI RISULTATI Calcolo computerizzato La riduzione dei dati computerizzati dell assorbenza per le Calibrators, eccetto il Calibrator 0, verso la concentrazione usando un regressione cubica flessibile potrebbe essere effettuata per ottenere la concentrazione di C-peptide. Il Calcolo manuale 1. Tracciare i valori di assorbenza ottenuti per le Calibrators, eccetto il Calibrator 0, contro la concentrazione di C-peptide in un registro e formula una calibratura curva. 2. Leggere la concentrazione dei campioni sconosciuti dalla calibratura curva. Esempio di risultati Pozzetti Identità A 450 Conc. princ. pmol/l 1A B 1C D 1E F 1G H 2A B 2C D 2E F 2G H 3A B Calibrator 0 Calibrator 1* Calibrator 2* Calibrator 3* Calibrator 4* Calibrator 5* Campioni 1 Campioni 2 Campioni 3 Concentrazione ha affermato sull etichetta della fiala / / / / / / / / /

8 Esempio di una calibratura curva Una calibratura rappresentativa è mostrata qui. Non usare questa curva per determinare i risultati attuali delle analisi. 10 O.D , C-peptide (pmol/l) LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non dovrebbe essere basata sui risultati di un singolo test, ma dovrebbe essere fatto medico dopo averne valutate le conclusioni cliniche. Grossolanamente campioni lipemic, itterico o hemolysed non interferiscono nell analisi. VALORI PREVISTI E buona norma e pratica di ogni laboratorio stabilire una serie del tutto sua di presunti valori. I seguenti risultati potrebbero servire come guida fino a che il laboratorio abbia raccolto dati sufficienti del tutto suoi. I livelli di digiuno per 136 esaminati, individui apparentemente sani, hanno reso un media di 742 pmol/l (2.2 μg/l), una mediana di 628 pmol/l (1.9 μg/l) e una serie corrispondente al centrale 95% delle osservazioni dei pmol/l ( μg/l). 8

9 CARATTERISTICHE E ESECUZIONE Il limite della scoperta Il limite di rivelazione è definito come Capacità di rivelazione in base a ISO11843-Part 1. La Capacità di rivelazione deve essere considerata come parte della convalida del metodo, e non come la concentrazione più bassa misurabile. Il limite di rivelazione è di 2.5 pmol/l ( µg/l) come determinato dalla metodologia descritta in ISO Part 4. La concentrazione di campioni con assorbanza inferiore al Calibrator 1 non devono essere calcolati, ma espressi come inferiori o uguali ( ) alla concentrazione indicata sulla fiala per il Calibrator 1. Recupero Il siero: Il recupero all aggiunta è % (media 99%). Il recupero alla diluizione è % (media 101%). Hook effect I campioni con una concentrazione sopra i 36 nmol/l può essere analizzata senza dare falsamente bassi risultati. Precisione Ogni campione è stato analizzato su 4 riprodotti in 5 diversi momenti. Coefficiente di variazione Campioni Valor principale pmol/l Nell analisi % Fra analisi % Totale analisi % Specificità La proinsulina in una concentrazione di 826 pmol/l hanno dato un risultato sotto il limite della scoperta. Per le altre peptide, sono state trovate le seguenti reazioni trasversali: Insulina < % Proinsulina <1.8% Proinsulina des (31 32) 3% Proinsulina split (32 33) 2% Proinsulina des (64 65) 74% Proinsulina split (65 66) 10% 9

10 CALIBRATURA Il kit Mercodia Ultrasensitive C-peptide ELISA specific è calibrato contro International Reference Reagent for C-peptide, IRR C peptide 84/510. IL FATTORE DI CONVERSIONE 1μg/L corrispondono a 331 pmol/l. GARANZIA I dati dei rendimenti presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB possono avere effetti su i risultati, nel caso in cui Mercodia AB rinuncia al diritto tutte le garanzie espresse, implicite o fissate, inclusa la garanzia implicita per l uso commerciale e appropriato. Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non sarà soggetto a danni indiretti o consequenziali. RIFERIMENTI Craig ME, Howard NJ, Silink M, Rawlinson WD (2003) Reduced frequency of HLA DRB1*03- DQB1*02 in children with type 1 diabetes associated with enterovirus RNA. J Infect Dis 187: Gaines-Das RE and Bristow, AF (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16: Ulteriori riferimenti sono disponibili sulla nostra pagina web: 10

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12 PROTOCOLLO DI SINTESI Mercodia Ultrasensitive C-peptide ELISA Aggiungere Calibrators, controlli* e campioni Aggiungere Assay Buffer IIncubazione Lavare piastra con soluzione wash buffer 1X Aggiungere di soluzione enzyme conjugate 1X Incubazione Lavare piastra con soluzione wash buffer 1X Aggiungere Substrate TMB Incubazione Aggiungere Stop Solution Misura A μl 50 μl 1 ora a C in una piastra shaker rpm 700 µl, 6 volte 100 μl 1 ora a C in una piastra shaker rpm 700 µl, 6 volte 200 μl 30 minuti a C 50 μl Scuotere per 5 secondi per assi curarsi Valutare i risultati Version 8.0