LAL TEST METODO GEL CLOT: ANALISI SULL ACQUA
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1 numero 16 marzo 2010 LAL TEST METODO GEL CLOT: ANALISI SULL ACQUA La Farmacopea Europea definisce i parametri che caratterizzano i tipi di acqua utilizzati in ambito farmaceutico, partendo dall acqua depurata per arrivare all acqua per preparazioni iniettabili. La caratteristica saliente di quest ultima è l apirogenicità: oltre ad essere sterile, l acqua non deve contenere più di 0,25 UI/ml di endotossine batteriche, per evitare l insorgenza di fenomeni febbrili dopo l iniezione. Il LAL test per la verifica delle endotossine batteriche nell acqua è quindi un test previsto dalla Farmacopea, ed è applicato sia in ambito farmaceutico che sanitario (acque di dialisi). Cercheremo di sintetizzarlo nelle prossime pagine, dando degli utili spunti per l esecuzione pratica. Basi del LAL Test Fino a trent anni fa, il metodo di elezione per verificare la presenza di pirogeni nelle sostanze iniettabili era rappresentato dal test sui conigli, con la misurazione dell aumento di temperatura negli animali in conseguenza all iniezione di un certo volume di prodotto. Attualmente, il LAL test è riconosciuto universalmente come alternativa al test dei pirogeni sui conigli e per molti prodotti rappresenta l unica metodica ufficiale. Base del test è la capacità degli amebociti estratti dal sangue di Limulus polyphemus (granchio a ferro di cavallo) di gelificare in presenza di endotossine batteriche provenienti da batteri Gramnegativi, responsabili dell effetto pirogeno. Gli amebociti rappresentano le uniche cellule circolanti nel sangue del Limulus polyphemus; al loro interno, vi sono granuli contenenti una serie di enzimi attivabili a cascata. Il lisato degli amebociti (Limulus Amebocyte Lysate) è il reagente base del LAL test. Le endotossine batteriche presenti nel campione in esame interagiscono con il lisato e, attivando la cascata enzimatica, causano la formazione del gel (da cui deriva il nome Gel Clot). LAL Test GEL CLOT Il test in vitro è molto semplice: il reagente LAL viene mescolato in provetta al campione in esame e lasciato fermo ad una temperatura di 37 C ± 1 per 60 ± 2 min. Al termine, la provetta viene tolta dall incubatore e capovolta di 180. Se sul fondo d ella provetta si è formato un gel che rimane stabile dopo l inversione, il test è positivo. Se il gel non si è formato o se si rompe durante l inversione, il test è negativo e il contenuto endotossinico del campione è da considerarsi inferiore alla sensibilità dichiarata per quel lisato. Pagina 1 di 6
2 Reagenti e accessori Per una buona riuscita del test, è fondamentale la scelta di reagenti e accessori. Al termine della rassegna, si trova una sezione riassuntiva dei prodotti specifici forniti da Kairosafe. Lisato La divisione Haemachem della Wako Chemicals Inc. propone il Limusate, polvere liofilizzata in flaconcini sotto vuoto con tappo a ghiera. I flaconcini possono contenere reagente per 10 o 50 test. Il lisato è caratterizzato dalla sensibilità (λ: concentrazione minima di endotossina rilevabile), espressa in Unità Endotossiniche (EU)/ml: il Limusate ha sensibilità 0.03 EU/ml, 0.06 EU/ml oppure EU/ml. Questo significa che, ad esempio nel primo caso, il lisato è in grado di rilevare nei campioni in esame concentrazioni endotossiniche pari o superiori a 0,03 EU/ml. Endotossina Standard Il lisato deve essere utilizzato in accoppiamento con una determinata Endotossina Standard, che funge da riferimento per la standardizzazione del test. Essa può essere RSE (ES di Riferimento) oppure CSE (ES di Controllo). Vengono entrambe utilizzate per la realizzazione di curve standard (sequenza di concentrazioni endotossiniche ottenute tramite diluizioni seriali della soluzione madre di CSE) oppure come semplice controllo positivo. La RSE (polvere liofilizzata) è rilasciata da USP e il suo contenuto è espresso in EU. Il flaconcino contiene EU. La CSE (polvere liofilizzata) è rilasciata dal produttore del reagente LAL e il suo contenuto è espresso in ng. Il flaconcino contiene 100 ng o più. Lisato e CSE sono accompagnati dal Certificato di Analisi, strumento fondamentale che riporta il fattore di conversione chiamato RSE/CSE ratio. Esso mette in relazione la CSE con la RSE e consente di calcolare il numero di EU presenti nel flaconcino di CSE. Consumabili Tutti i materiali che vengono a contatto con reagenti e campioni devono essere apirogeni (esenti da endotossine), in particolare devono essere certificati con un contenuto endotossinico inferiore a 0,001 EU/ml. Devono altresì essere esenti da interferenze. L acqua è necessaria per la ricostituzione di lisato e CSE, oltre che per le varie diluizioni richieste durante il test. Kairosafe mette a disposizione acqua LAL in flaconcini di vetro con tappo a ghiera ad apertura facilitata, in vari volumi (30, 50, 100, 500 ml). Le provette per l incubazione e la preparazione dei campioni, come pure le pipette per le dispensazioni, sono in vetro borosilicato. In alternativa alle pipette, possono essere utilizzati i puntali di plastica, apirogeni certificati e testati per eventuali interferenze. Accessori Il mescolamento omogeneo delle soluzioni nelle varie fasi del test va garantito con un vortex a velocità variabile. Per l incubazione dei campioni è richiesto un incubatore a secco multi pozzetto, in grado di mantenere la temperatura richiesta per tutta la durata del test. Pagina 2 di 6
3 PARAMETRI Nell allestimento del test, bisogna tener conto di alcuni parametri essenziali: Limite ufficiale del prodotto in esame L acqua per preparazioni iniettabili non deve avere un contenuto endotossinico superiore a 0,25 EU/ml. Sensibilità del lisato utilizzato (λ) Più basso è il valore di λ, maggiore è il margine di sicurezza per i risultati del test. Diluizione del prodotto in esame La massima diluizione del campione (MVD) dipende dal suo limite endotossinico (EL) e dalla sensibilità del lisato utilizzato, secondo una semplice formula: MVD= EL / λ. Utilizzando un lisato con sensibilità pari a 0,125 EU/ml, il campione di acqua potrà essere diluito, se necessario, al massimo di due volte (MVD = 0,25/0,125 = 2). ALLESTIMENTO DEL TEST Prendiamo in considerazione il test su un campione di acqua, utilizzando un lisato con sensibilità λ pari a 0,125 EU/ml ed un flacone di CSE da 100 ng. Testando il campione tal quale con questo lisato, si intende verificare se il campione in esame ha un contenuto endotossinico inferiore a 0,125 EU/ml, la metà del limite ufficiale 0,25 EU/ml. Se si desidera verificare un contenuto endotossinico inferiore al limite ufficiale, è sufficiente diluire il campione originale 1:2. Convalida del lisato Prima di procedere con il test di routine sul campione, è necessario controllare la sensibilità del lisato effettuando la convalida del lisato. Questa operazione va ripetuta ogni volta che si cambia il lotto di lisato o quando variano le condizioni sperimentali (laboratorio, operatori, strumenti ). A partire dalla soluzione madre di CSE, va allestita una serie di diluizioni in acqua di endotossina standard, fino ad ottenere le concentrazioni 2λ, λ, λ/2, λ/4. Questa curva standard va completata dai controlli negativi, costituiti da acqua LAL. Ogni concentrazione e controllo negativo è testato in 2 repliche. a. Ricostituzione dei reagenti La ricostituzione del lisato è la prima operazione da effettuare, ed è molto delicata, in quanto una contaminazione accidentale può compromettere l esito del test. Il flacone di lisato da 50 test viene ricostituito con 5 ml di acqua LAL, quello da 10 test con 1 ml di acqua LAL. Il flacone va lasciato fermo e, una volta dissolta perfettamente la polvere, va mantenuto in frigorifero e utilizzato a temperatura ambiente. Il flacone di CSE va ricostituito con 2 ml di acqua LAL e quindi vortexato per 20 minuti continuati o per 5 minuti a intermittenza (5 minuti di vortex + 1 min di pausa fino ad un totale di 20 minuti totali di vortex). Il mescolamento dell endotossina è un passaggio critico in tutte le fasi del test: l endotossina tende a formare aggregati, con conseguente formazione di soluzioni non omogenee e compromissione dell esito del test. La soluzione madre così ottenuta si conserva in frigorifero e prima di ogni utilizzo deve essere vortexata per 5 minuti. Pagina 3 di 6
4 b. Preparazione delle diluizioni di CSE Le diluizioni vengono preparate partendo dalla soluzione madre di CSE, fino ad arrivare alle concentrazioni 2λ, λ, λ/2, λ/4. Queste ultime costituiscono la cosiddetta curva standard. La sensibilità dichiarata per il lisato è 0,125 EU/ml, quindi la curva standard è la seguente: 0,25 0,125 0,0625 0,03125 EU/ml Prendiamo ad esempio un certificato di analisi che riporti il seguente fattore di conversione: 10 EU/ng. Ciò significa che i 100 ng di endotossina contenuti nel flaconcino di CSE corrispondono a 1000 EU. Seguendo le istruzioni del produttore, la CSE viene ricostituita con 2 ml di acqua, ottenendo così una soluzione madre contenente 500 EU/ml. Per convenzione, si inizia con diluizioni 1:10, e si prosegue con diluizioni 1:2. Si può adottare lo schema seguente: 0,2 ml CSE 500 EU/ml + 1,8 ml di H 2 0 LAL 50 EU/ml 0,2 ml CSE 50 EU/ml + 1,8 ml di H 2 0 LAL 5 EU/ml 0,2 ml CSE 5 EU/ml + 1,8 ml di H 2 0 LAL 0,5 EU/ml 1,5 ml CSE 0,5 EU/ml + 1,5 ml di H 2 0 LAL 0,25 EU/ml (2λ) 1,5 ml CSE 0,25 EU/ml + 1,5 ml di H 2 0 LAL 0,125 EU/ml (λ) 1,5 ml CSE 0,125 EU/ml + 1,5 ml di H 2 0 LAL 0,0625 EU/ml (λ/2) 1,5 ml CSE 0,0625 EU/ml + 1,5 ml di H 2 0 LAL 0,03125 EU/ml (λ/4) Le diluizioni vengono di solito preparate in provette 13 x 100 mm, o più grandi, appositamente contrassegnate: si inizia dispensando l acqua in tutte le provette, quindi si procede con la CSE prelevata dalla provetta a concentrazione maggiore, a partire dalla soluzione madre. Tra una diluizione e l altra, bisogna avere l accortezza di mescolare su vortex le soluzioni per c. Preparazione delle provette test e incubazione Le provette test (10 x 75 mm) sono così suddivise, ciascuna in due repliche: Controlli Negativi: 0,1 ml di acqua LAL 2λ, λ, λ/2, λ/4: 0,1 ml della soluzione di CSE corrispondente preparata al punto b. A tutte le provette si aggiungono 0,1 ml di lisato a temperatura ambiente, quindi si agitano leggermente e si inseriscono in incubatore a 37± 1 C, dove si lasciano per 60 ± 2 minuti. Tempo e temperatura di incubazione sono parametri critici, da rispettare rigorosamente. d. Risultati Trascorso il tempo di incubazione, le provette si prelevano dall incubatore iniziando dai Controlli Negativi e procedendo con le concentrazioni endotossiniche in ordine crescente. Le provette vanno ruotate di 180 con movimento lento e uniform e, fino a che il fondo della provetta non si trova rivolto verso l alto. Il test è Positivo (segno +) se il gel rimane stabile sul fondo della provetta, Negativo (segno -) se il gel non si è formato o se si rompe durante la rotazione. Esempio: Controlli Negativi: - - 0,03 EU/ml: - - 0,06 EU/ml: - + 0,125 EU/ml: + + 0,25 EU/ml: + + Per verificare se il test è accettabile si deve calcolare la media geometrica degli endpoint (le prime concentrazioni che danno reazione positiva), espressi come logaritmi decimali. Pagina 4 di 6
5 Si ottiene così il valore λ' (sensibilità calcolata). Solo se λ' cade nell intervallo di accettabilità λ/2 λ' 2λ il lisato è convalidato. Considerando l esempio, si avrà: λ = antilog[(log0,06+log0,125)/2] = 0,087 EU/ml Il valore 0,087 è compreso nell intervallo 0,06 λ' 0,25 e quindi il lisato è convalidato. Si può a questo punto procedere con il test sul campione Esecuzione del LAL test sul campione di acqua Il test sul campione viene sempre eseguito in due repliche, parallelamente ai Controlli Positivi e Negativi in acqua LAL, oppure alla convalida del lisato se cambiano il lotto di lisato e/o le condizioni sperimentali. Quindi, per il test di routine sull acqua sono previsti i seguenti campioni, tutti in 2 repliche nelle provette test 10 x 75 mm: 1) acqua campione: 0,1 ml di campione (l acqua normalmente viene testata tal quale, non diluita). 2) controllo positivo dell acqua campione: 0,1 ml di campione, contenenti una quantità pari a 2λ di endotossina CSE: è il cosiddetto spike, che ha lo scopo di mettere in evidenza le eventuali interferenze del campione nei confronti della reazione LAL-endotossina. Possiamo preparare questo campione aggiungendo a 0,09 ml di acqua campione 0,01 ml di CSE 20λ (corrispondente a 2,5 EU/ml, ricavabile diluendo 1:2 la soluzione 5 EU/ml al punto b ). 3) controllo negativo in acqua LAL: 0,1 ml di acqua LAL. 4) controllo positivo in acqua LAL: 0,1 ml di acqua LAL, contenenti una quantità pari a 2λ di endotossina CSE (corrisponde alla soluzione 2λ preparata al punto b ). Ad ognuna delle provette di cui ai punti 1), 2), 3) e 4) si aggiungono 0,1 ml di lisato ricostituito, a temperatura ambiente. Le provette vanno leggermente scosse e immediatamente messe ad incubare alle condizioni già indicate. Risultati del LAL test sul campione di acqua I controlli negativi in acqua LAL devono essere negativi (un risultato positivo è indice di contaminazione). I controlli positivi devono essere positivi. Un risultato negativo può essere indice di interferenza nella reazione o di funzionamento/utilizzo scorretto dei reagenti. Se solo una delle due repliche è negativa il test va ripetuto. Se l acqua campione ha risultato negativo allora il suo Contenuto Endotossinico è inferiore a: sensibilità λ fattore di diluizione. Nel nostro esempio, λ è 0,125 EU/ml e il campione di acqua è stato testato tal quale, quindi il Contenuto Endotossinico sarebbe inferiore a 0,125 EU/ml (0,125 1), ben al di sotto del limite ufficiale (0,25 EU/ml). Se l acqua campione ha risultato positivo allora il suo Contenuto Endotossinico è maggiore a: sensibilità λ fattore di diluizione. Nel nostro esempio il Contenuto Endotossinico sarebbe maggiore a 0,125 EU/ml (0,125 1). Il campione può essere testato alla diluizione 1:2 (MVD, considerando la sensibilità del lisato utilizzato) per verificare se il Contenuto Endotossinico (stavolta 0,125 2) è comunque inferiore al limite ufficiale di 0,25 EU/ml. Pagina 5 di 6
6 Prodotti nel catalogo KAIROSafe: Reagenti ed Endotossine Lisato per test multipli in flaconcini da 10 o 50 test, sensibilità 0,03-0,06-0,125 EU/ml (WAKO) Endotossina Standard di Controllo, CSE (WAKO) Endotossina Standard di Riferimento, RSE (USP), BRP (EP) Endotossine per la convalida dei processi di depirogenazione (ACILA) Consumabili apirogeni ACILA con certificato di apirogenicità Acqua LAL ml Soluzioni tampone, soluzioni acide e basiche Provette, pipette di borosilicato Provette, pipette, puntali, serbatoi, piastre, flaconi, Strumentazione dedicata Incubatori a secco Pipette elettroniche e micro-dosatori automatici Vortex Il sito è stato completamente rinnovato. Con una semplice registrazione potrete visionare i nostri LISTINI PREZZO sempre aggiornati. I clienti registrati avranno anche la possibilità di godere di speciali offerte promozionali. Siamo sempre a disposizione per offerte personalizzate. Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Tel/fax: info@kairosafe.it web: Pagina 6 di 6
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