1. Procedure di valutazione dello sviluppo microbico

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1 1. Procedure di valutazione dello sviluppo microbico Analisi sperimentali Materiale Metodi diretti Microrganismo: Saccharomyces cerevisiae Terreno colturale: MEB Composizione (g/l) MEB: estratto malto 20, peptone di soia 1, glucosio 20, acqua di fonte, ph 5.8 Colture allestite in beute da 500 ml contenenti ciascuna 100 ml di terreno colturale numero di cellule conta totale (conta diretta) al microscopio conta biologica in piastra massa cellulare peso secco Metodi indiretti turbidimetria (assorbanza 600 nm)

2 1 giorno Procedura allestimento colture preparazione beute Inoculo con coltura in solido (slant) di Saccharomyces cerevisiae incubazione in agitazione a C allestimento inoculo 2 giorno 3 giorno inoculo di ciascuna beuta con 10 ml della coltura di inoculo e determinazioni t 0 (conta totale, conta in piastra e OD) incubazione in agitazione a C determinazione dello sviluppo microbico impiegando le diverse procedure (conta totale, conta in piastra, peso secco e OD) preparazione campioni

3 Campioni Prelievi della coltura di Saccharomyces cerevisiae opportunamente diluiti Conta totale Materiale Camera emocitometrica Sulla superficie della camera sono incise 2 copie del reticolo di conta posizione reticoli Conta totale camera di Bürker schema reticolo di conta

4 Preparazione della camera di conta posizionare il coprioggetto con una pipetta si inserisce per capillarità il campione opportunamente diluito coprioggetto campione Conta totale reticolo camera di conta Per la conta si utilizza un microscopio contrasto di fase (400 ingrandimenti)

5 Contare le cellule che si presentano all interno e su 2 lati contigui del campo prescelto in funzione della densità/dimensione delle cellule cellule da contare cellule da non contare Conta totale Esercitazione 1

6 Effettuare la conta di 10 campi (A, B o C) scelti dall operatore per ciascuno dei 2 reticoli (totale 10 conte x 2 reticoli = 20 determinazioni) Calcolare il valore medio A C B Considerando le dimensioni del reticolo (in particolare per A, B o C) determinare la popolazione presente nel campione Conta totale Dimensioni dei singoli riquadri del reticolo RIQUADRO LATO AREA VOLUME (mm) (mm 2 ) (spessore 1/10 mm) A 1/20 1/400 1/4.000 B 1/20 x 1/5 1/100 1/1.000 C 1/5 1/25 1/250

7 Calcolo per la determinazione della popolazione presente nel campione Riq. A: n cellule (valore medio) x 4.000* x 1.000** x diluizione del campione Riq. B: n cellule (valore medio) x 1.000* x 1.000** x diluizione del campione Riq. C: n cellule (valore medio) x 250* x 1.000** x diluizione del campione * fattore in funzione del volume del reticolo in cui è stata effettuata la conta (A, B o C) ** fattore per il passaggio da mm 3 (in relazione alle dimensioni sei singoli riquadri) a cm 3 (ml) Conta totale 1/4.000 di mm 3 A C B 1/250 di mm 3 1/1.000 di mm 3

8 Conta biologica in piastra Materiale Provette conteneti 9 ml di soluzione fisiologica Terreno colturale: agar malto Piastre sterili Procedura allestimento diluizioni decimali in soluzione fisiologica inoculo in piastra delle singole diluizioni campione incubazione a C per 48 ore Conta biologica in piastra 1 ml Conta UCF (Unità Formanti Colonie)

9 Campione in piastra Introduzione terreno colturale Conta biologica in piastra Conta UCF Incubazione Fase di mescolamento

10 Peso secco Materiale Provette da centrifuga Centrifuga Stufa Termobilancia Procedura Centrifugazione di un volume noto di brodocoltura Lavaggio delle cellule (1/2 volte) Essiccamento in stufa C fino a peso costante Peso secco CAMPIONE filtrazione/centrifugazione essiccamento Peso del campione in termobilancia Peso delle cellule dopo essiccamento

11 Campione e provette Centrifugazione/lavaggio Peso secco Pesata Essiccamento in stufa

12 Turbidimetria Materiale Spettrofotometro (600 nm) Procedura Diluizione del campione Turbidimetria Determinazione assorbanza a 600 nm contro acqua

13 Esercitazione 2 Immobilizzazione/fermentazione Copyright 2009 M. Manzoni 2. Fermentazione alcolica - Saccharomyces cerevisiae Impiego di cellule di cellule libere e immobilizzate (alginato di calcio) Finalità della sperimentazione Valutazione della capacità fermentativa di cellule libere e immobilizzate Rilevazione della CO valutazione dello sviluppo di CO 2 nel tempo glucosio 2 etanolo + 2 CO 2 Fase sperimentale cellule immobilizzate S. cerevisiae Prove comparative cellule libere

14 Esercitazione 2 Immobilizzazione/fermentazione Schematizzazione sperimentazione Soluzione di NaCl satura Buretta da gas Valvola a 3 vie Copyright 2009 M. Manzoni Reattore contenente le cellule e la soluzione zuccherina

15 Esercitazione 2 Immobilizzazione/fermentazione Cellule immobilizzate Materiale Alginato di Na 2% p/v CaCl 2 0,1 M Sospensione di lievito (Saccharomyces cerevisiae): 10,7 g di lievito compresso o il Alginato di Na Copyright 2009 M. Manzoni corrispondente sul secco di lievito essiccato, sospesi in 20 ml di acqua. Lievito compresso Lievito essiccato CaCl 2

16 Esercitazione 2 Immobilizzazione/fermentazione Cellule di Saccharomyces cerevisiare immobilizzate Copyright 2009 M. Manzoni

17 Esercitazione 2 Immobilizzazione/fermentazione Procedura 20 ml di alginato di Na (solubile) + 20 ml della sospensione cellulare estrusione tramite siringa in CaCl 2 16 h di sosta a 5 C formazione di alginato di Ca (insolubile) lavaggio con acqua distillata delle cellule immobilizzate Preparazione cellule immobilizzate Copyright 2009 M. Manzoni 35 ml glucosio o altro zucchero (al 2%) + cellule immobilizzate (o libere) incubazione in reattore a 30 C rilevazione volumetrica della CO 2 sviluppata Allestimento della fermentazione

18 Esercitazione 2 Immobilizzazione/fermentazione Copyright 2009 M. Manzoni Giorno 3: Produzione di CO 2 con cellule libere e immobilizzate Sospensione di lievito (Saccharomyces Trasferire le sfere di immobilizzato nel cerevisiae): 10,7 g di lievito compresso o il reattore corrispondente sul secco di lievito essiccato, sospesi in 20 ml di acqua. Cellule immobilizzate Cellule libere Tutte le sfere di immobilizzato (20 ml 20 ml della sospensione cellulare di sospensione cellulare) sono sono trasferiti nel reattore trasferite nel reattore incamiciato. incamiciato. Vengono aggiunti 35 ml di una Vengono aggiunti 35 ml di una soluzione di saccarosio al 2%. soluzione di saccarosio al 2%. Reattore termostatato a 30 C, si Reattore termostatato a 30 C, si verifica la produzione di CO 2 ogni 5 verifica la produzione di CO 2 ogni 5 min per 1 h. min per 1 h.

19 Esercitazione 2 Immobilizzazione/fermentazione Suggerimento per l elaborazione dei dati Analisi comparativa dei risultati relativi alle prove allestite in reattorino con cellule libere e immobilizzate, con particolare riferimento alle rese di conversione del substrato zuccherino in etanolo, rispetto al valore stechiometrico, teorico. Costruzione delle curve di sviluppo di CO 2 e valutazione delle differenze relative alla produttività volumetrica. Copyright 2009 M. Manzoni

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