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21 Metaboliti primari Metaboliti secondari

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23 Fermentazione Fermentatori Fermentatori anaerobici più semplici. Rimozione del calore sprigionato durante la fase 5-10 di litri fermentazione litri uso laboratorio uso industriale Fermentatori aerobici più elaborati per assicurare un adeguata miscelazione ed ossigenazione. La maggior parte delle fermentazioni aerobici industriali anaerobici avviene in condizioni aerobiche.

24 Fermentatori Cilindro in acciaio inossidabile chiuso alle due estremità. Poiché sterilizzazione e rimozione del calore sono essenziali per una fermentazione ottimale, il fermentatore possiede una camicia di raffreddamento in cui possono scorrere vapore o acqua di raffreddamento. Parte fondamentale del processo è il sistema di aerazione

25 Fermentatori Per assicurare un adeguata aerazione: 1. Diffusore 2. Agitatore Microrganismi O 2 Poco solubile in ambiente liquido In fermentatori con alta densità di popolazione microbica vi è un alta richiesta di ossigeno Camicie di raffreddamento

26 Microrganismi O 2 Camicie di raffreddamento

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29 Controllo e monitoraggio della fermentazione Non solo monitorare la crescita e controllare la formazione di prodotti, ma anche controllare il processo modificando i parametri ambientali nel corso della fermentazione Temperatura ph Concentrazione di O 2 Massa cellulare Concentrazione del prodotto

30 Scale-up (aumento dimensionale) Trasferimento di un processo industriale dal laboratorio a fermentatori industriali 1L 5-10 L L L beuta Fermentatore Lab. Impianto pilota Fermentatore In. Aerazione monitorata per monitorare la domanda di O 2 Agitazione e aerazione sono molto più facili in piccoli fermentatori

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32 Produzione Penicillina G (antibiotico b lattamico) Metabolita secondario Prodotto in piccole quantità durante la fase log. Produzione aumentata durante la fase S. Cefalosporine (fungo Cephalosporium acremonium) Mezzo di coltura contiene Tossicità sciroppo bassa di mais (azoto ed altri fattori di crescita) fonte di carbonio: lattosio Ampio spettro antibiotico Cellule rimosse per filtrazione ph abbassato Estrazione mediante solvente organico e successiva cristallizzazione

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34 Tetraciclina e derivati (clorotetracilcina) Metabolita secondario Prodotto in piccole quantità durante la fase log. Produzione aumentata durante la fase S. Circa 70 prodotti intermedi Produzione Coinvolti circa 300 geni in Streptomyces aureofaciens Glucosio viene evitato come zucchero in quanto origina il fenomeno (regolazione) conosciuta come repressione da cataboliti. Mezzo di coltura contiene sciroppo di mais (azoto ed altri fattori di crescita) fonte di carbonio: saccarosio antibiotico Cellule rimosse per filtrazione ph Estrazione

35 Tetraciclina

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44 Densità ottica di una coltura batterica Misura la quantità di cellule batteriche in una soluzione. Più alto è il numero di cellule maggiore sarà la densità. Questo significa che minor luce attraverserà la soluzione e la coltura sembrerà torbida. Lo spettrofotometro è uno strumento che misura la quantità di luce in grado di attraversare attraverso una coltura batterica. Se la luce colpirà la cellula batterica verrà deviata. Più torbida è la coltura minore sarà la capacità del fascio luminoso di attraversarla e maggiore sarà la deviazione. La quantità di luce riflessa verrà registrata dallo spettrofotometro.

45 1 ml

46 hsp 18.5 hsp hsp 19.3

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48 Attività proteasica e amilasica Piastre di Attività terreno amilasica contenente amido (Nutrient Agar contenente 10 g/l di amido solubile. Nutrient agar: estratto di carne 3g, peptone 5g, agar 15g ph Endosplitting sterilizzare 121 C 20 Amilasi, enzimi idrolitici extracellulari sono ubiquitari. Dall azione delle amilasi si ottengono le destrine, successivamente il maltosio (disaccaride) ed il glucosio. Le amilasi, prodotte da diversi microrganismi, possono essere suddivise in: 2. Esosplitting 3. Debrancing Amido Amilosio (catene lineari) ed Amilopectina (catene ramificate)

49 Aggiungere soluzione di Lugol (reattivo a base di iodio) Reagisce con amido dando origine ad una intensa colorazione blu/viola Eccesso di Lugol eliminato dalla superficie delle piastre. La presenza di aloni/aree nella vicinanza delle colonie microbiche Indica digestione dell amido

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51 Attività proteasica Attività proteasica Piastre di terreno contenente caseina e Milk agar Milk agar: skim milk 50g, agar 15g sterilizzare skim milk ed agar separatamente in 500ml di acqua C 20

52 Il terreno per la ricerca di attività proteasica si presenta torbido per la presenza di caseina. La presenza di aloni/aree nella vicinanza delle colonie microbiche (per effetto di idrolisi della caseina) indica presenza di proteasi

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55 Attività: produzione di acidi (acido citrico, lattico, acetico etc.) Etanolo (Acetobacter, Gluconobacter) Acido acetico (Acetobacter) H 2 O e CO 2 Entrambi i generi sono in grado di ossidare etanolo ad acido acetico, tuttavia solo Acetobacter effettua l ossidazione completa ad H2O e CO2

56 Attività: produzione di acidi Terreno di Frateur: estratto di lievito 10g, CaCO 3 20, etanolo 20 agar 20, ph sterilizzare C 20 (etanolo aggiunto dopo sterilizzazione) Terreno al verde di bromocresolo: Lievito 30, agar 20, soluzione al verde di bromocresolo 1ml

57 Inoculare le piastre ed incubare a 28 C fino a completo sviluppo. A sviluppo avvenuto è possibile evidenziare la formazione di acido acetico in entrambi i terreni di coltura.

58 Terreno di Frateur: alone di chiarificazione dovuto alla scomparsa del carbonato per effetto dell acidità

59 Terreno al verde di bromocresolo: si ha il viraggio dell indicatore da verde/blu a giallo nell area in cui è presente acido acetico. Per i ceppi di Gluconobacter tali modifiche risultano stabili nel tempo. Nessun viraggio - test negativo.

60 La successiva ossidazione dell acido prodotto, operata solo dai ceppi di Acetobacter, causa la rideposizione del carbonato di calcio e il ri-viraggio dell indicatore che passa da giallo a verde/blu. Variazioni dovute all innalzamento del ph (verso la neutralità) per scomparsa dell acido acetico, ossidato ad acqua ed anidride carbonica.

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