Corso di: Colture vegetali e applicazioni biotecnologiche

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Dario Piva
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1 LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE Corso di: Colture vegetali e applicazioni biotecnologiche Dott.ssa G. Massaro Tel giuseppina.massaro@unina2.it 1a Lezione del 21/01/2011

2 Le tecniche di coltura si basano, principalmente, su due caratteristiche delle cellule vegetali: Plasticità Totipotenza

4 Terreni per colture vegetali: Le condizioni nutrizionali sono simili alle condizioni in cui la cellula o la pianta intera si trovano in natura Sono costituiti da soluzioni acquose (H distillata) 2O Il substrato su cui si sviluppano le colture deve garantire che l espianto abbia disponibilità di tutte le sostanze di cui questo necessita. È sempre costituito da acqua e da una serie di sali e di sostanze organiche, ad una certa temperatura e ph.

5 Terreni per colture vegetali: Liquido Solido

6 Composizione dei Terreni di Coltura: Nutrienti minerali Nutrienti organici Sostanze di crescita

7 Nutrienti minerali Le piante sono organismi autotrofi che possono sintetizzare tutti i loro componenti organici molecolari a partire da elementi nutritivi inorganici, che hanno origine minerale oppure che si sono mineralizzati a seguito di decomposizione della sostanza organica. Gli elementi di origine minerale sono assorbiti in forma ionica dalla pianta. Alcuni elementi vengono detti essenziali. Un elemento essenziale è definito come un elemento con un determinato ruolo fisiologico, la cui assenza impedisce il completamento del ciclo biologico di una pianta.

8 Macronutrienti Elemento Disponibile come Micronutrienti Elemento Disponibile come

9 Mengel e Kirkby (1979) proposero di classificare gli elementi essenziali in 4 gruppi a seconda del loro ruolo biochimico e della loro funzione fisiologica.

10 Gruppo 1

11 Gruppo 2

12 Gruppo 3

13 Gruppo 4

14 Amminoacidi Carboidrati Nutrienti organici Monosaccaridi (glucosio) Disaccaridi (saccarosio) In genere l aggiunta di un singolo amminoacido (tranne la glicina) ha effetti inibitori, si preferisce utilizzare un idrolizzato di caseina ( %) oppure l amminoacido glicina con o senza l aggiunta di altri amminoacidi quali asparagina, glutammina, tirosina, arginina, cisteina. Acido Nicotinico Vitamine Saccarosio è il carboidrato più utilizzato nelle colture vegetali alla concentrazione del 2-3% (w/v) Piridossina Tiamina Biotina Le vitamine sono cofattori enzimatici in reazioni del metabolismo. Tra questi la tiamina è essenziale per la crescita di organismi fotosintetici superiori.

15 Regolatori di crescita: ormoni Gli ormoni impiegati nelle colture sono: Auxine: stimolano la divisione e la moltiplicazione cellulare (favoriscono la duplicazione del DNA), promuovendo la radicazione e l allungamento cellulare; Citochinine: stimolano la divisione cellulare, la formazione dei germogli; Gibberelline: sono impiegate per interrompere della dormienza dei semi e per stimolare l allungamento dei germogli. Invece, l Acido abscissico e l Etilene non sono utilizzati nelle colture.

16 È necessario creare e mantenere condizioni asettiche, perché i terreni di coltura essendo ricchi di sostanze organiche ed inorganiche risultano ambiente ideale per la crescita di funghi e batteri contaminanti. Tali organismi crescono più velocemente delle cellule vegetali, ed alterano la composizione del mezzo di coltura (consumando sostanze e producendo metaboliti e tossine che concorrono alla variazione della composizione del terreno).

STERILIZZAZIONE Il terreno di coltura, come anche i contenitori (capsule Petri, beute o tubi) e gli strumenti (bisturi, lamette, pinzette) vengono autoclavati in umido a 120 C a 2 atm

17 STERILIZZAZIONE Il terreno di coltura, come anche i contenitori (capsule Petri, beute o tubi) e gli strumenti (bisturi, lamette, pinzette) vengono autoclavati in umido a 120 C a 2 atm per minuti. Gli strumenti all atto dell utilizzo vengono ulteriormente sterilizzati mediante lavaggio con etanolo al 70% o sodio ipoclorito (candeggina) a 1-2 % per alcuni secondi.

18 Sterilizzazione del materiale vegetale AGENTE CONCENTRAZIONE TEMPO DI DISINFEZIONE Etanolo Ipoclorito H 2 O2 AgNO3 HgCl2 Antibiotici % 5-15 % 3-12 % 1 % % 4-5 mg/l pochi secondi - 2 minuti 5-30 minuti 5-15 minuti 5-30 minuti 2-10 minuti minuti

19 Motore e pre-filtri Lampada UV Filtri 0,2 µm Ripiano sterilizzabile

20 Condizioni di Crescita Temperatura: C; Illuminazione: almeno 200 µe m-2 s-1; Fotoperiodo: in genere 16 h di luce / 8 ore di buio

21 Una proprietà importante dei terreni nutritivi è il ph. Il ph del suolo può influire sull accrescimento delle piante e dei microrganismi. Lo sviluppo delle radici è favorito a valori di ph leggermente acidi (da 5.5 a 6.5) I funghi sono predominanti nei suoli con valori di ph acidi I batteri si sviluppano maggiormente nei suoli con valori di ph alcalini

22 Influenza del ph sulla disponibilità degli elementi nutritivi Il ph è fondamentale per mantenere lo stato di solubilità degli elementi e ottimizzare i processi di scambio fra le radici e la soluzione nutritiva. A valori di ph più basso diventano più solubili i sali presenti nel suolo come carbonati, solfati e fosfati facilitandone l assorbimento da parte delle radici.

23 ph del terreno

24 Colture

25 Colture : come si fa?

26 Colture

27 Colture

28 Problemi delle colture tradizionali:

29 Problemi delle colture tradizionali:

32 Grazie per la cortese attenzione

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