Coltura di cellule vegetali

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Battistina Franco
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1 BIOTECNOLOGIE CELLULARI modulo di Tecniche Cellulari Vegetali Inoculo nel mezzo di coltura liquido Controllo della crescita (eventuale sub-cultura)

2 Il callo è un tessuto costituito da cellule indifferenziate, di tipo parenchimatico. Al fine di indurre la formazione di callo da tessuto differenziato, è necessario: 1. selezionare un espianto idoneo alla proliferazione delle cellule, con conseguente formazione di callo; 2. identificare un appropriato mezzo di coltura per lo sdifferenziamento e per la rapida divisione cellulare; 3. isolare le cellule proliferanti dal tessuto d'origine e sostenere la crescita del callo 1. selezionare un espianto idoneo alla proliferazione delle cellule, con conseguente formazione di callo friabile - il materiale di partenza migliore è quello in cui i tessuti sono allo stato giovanile. Sono quindi da preferire piantine giovani provenienti da seme;

3 1. selezionare un espianto idoneo alla proliferazione delle cellule, con conseguente formazione di callo friabile Il tessuto migliore per una rapida proliferazione cellulare è quello parenchimatico, in quanto presenta un basso livello di differenziazione; inoltre mantiene questo potenziale anche per molti anni (parenchima vecchio di 25 anni da fusto di Tilia). Espianti in cui il tessuto parenchimatico è largamente rappresentato sono: l'apice ed il cilindro corticale, le radici, i tuberi, il mesofillo fogliare, la polpa dei frutti succulenti, l'endosperma dei semi; 1. selezionare un espianto idoneo alla proliferazione delle cellule, con conseguente formazione di callo friabile cilindro corticale! tuberi!

4 1. selezionare un espianto idoneo alla proliferazione delle cellule, con conseguente formazione di callo friabile polpa di frutti succulenti! endosperma! 1. selezionare un espianto idoneo alla proliferazione delle cellule, con conseguente formazione di callo friabile - in genere, tutte le piante presentano tessuti favorevoli alla produzione di callo. Le piante xerofite, per la difficoltà di raggiungere il tessuto parechimatico, e quelle acquatiche per problemi di sterilità, risultano quelle per le quali è più difficile ottenere espianti coltivabili in vitro.

5 2. identificare un appropriato mezzo di coltura per lo sdifferenziamento e per la rapida divisione cellulare - il mezzo di coltura deve indurre almeno alcune cellule a rientrare nel ciclo mitotico, divenendo così cellule meristematiche; - la scelta della composizione chimica del mezzo di coltura tra quelli presenti in letteratura segue le indicazioni bibliografiche di esperimenti condotti in precedenza. Ad esempio, ottimale è risultato il mezzo MS per il tabacco, ma per gli ipocotili di soia il mezzo migliore è il B5 di Gamborg. Il mezzo agarizzato è migliore di quello liquido. 2. identificare un appropriato mezzo di coltura per lo sdifferenziamento e per la rapida divisione cellulare

6 2. identificare un appropriato mezzo di coltura per lo sdifferenziamento e per la rapida divisione cellulare - tipo e quantità di ormoni per lo sdifferenziamento variano grandemente secondo la specie vegetale e, spesso, secondo anche la varietà; è questo un carattere spiccatamente genotipo-dipendente. In alcuni casi è necessaria l aggiunta di latte di cocco deproteinizzato e/ o di idrolizzato di caseina per ottenere la crescita del callo; - per favorire la produzione di callo, espianti ad accrescimento polare (germogli) devono essere posti sul substrato agarizzato a polarità alto-basso invertita. 2. identificare un appropriato mezzo di coltura per lo sdifferenziamento e per la rapida divisione cellulare - in caso di difficile od assenza di riferimenti bibliografici, un punto di partenza per la composizione del mezzo di coltura è con macro- e micro-elementi della formulazione di Murashige e Skoog, il complesso vitaminico del B5 di Gamborg, 0,1-2,0 mgl -1 di auxina da sola o in combinazione con 0,1-2,0 mgl -1 di citochinina, gl -1 di saccarosio; - la temperatura per lo sviluppo di callo è generalmente posta a C; la crescita è migliore al buio.

7 3. isolare le cellule proliferanti dal tessuto d'origine e sostenere la crescita del callo - dopo circa 2-3 settimane dall'inoculo, il callo proliferante è visibile sull'espianto come una escrescenza o una protuberanza, oppure come una cicatrice sviluppatasi sulla zona del taglio; esso si deve presentare di colore ialino o giallo chiaro e, soprattutto, di consistenza friabile; - un incremento di 2x della concentrazione delle auxine spesso previene la rizogenesi; - è buona pratica prelevare porzioni del callo quando è di 2-3 cm di diametro, come inoculi per la sub-cultura. 3. isolare le cellule proliferanti dal tessuto d'origine e sostenere la crescita del callo

8 3. isolare le cellule proliferanti dal tessuto d origine e sostenere la crescita del callo - è necessario evitare l'invecchiamento del callo, che si mostra come una riduzione dell accrescimento, la presenza di aree brune o necrotiche. L'invecchiamento è dato da:! riduzione della disponibilità delle sostanze nutritive;! inibizione della diffusione delle sostanze di crescita;! evoparazione dell'acqua con conseguente alterazione della concentrazione ottimale delle sostanze disciolte nel mezzo;! accumulo di prodotti del metabolismo e del catabolismo cellulare ad attività citostatica o citotossica. Produzione di callo friabile da embrioni di Croton bonplandianum. 1. Coltura di 10 giorni di embrioni decorticati; 2. coltura di un mese: notare il callo da radice (cr) e dall endosperma (ce); 3. profusa crescita di callo da endosperma dopo un mese di coltura.

9 Produzione di callo friabile da cotiledoni di pomodoro Produzione di callo da foglie di piante micropropagate di patata in presenza di Picloram

10 Callo friabile da foglie di piante micropropagate di patata indotto da Picloram Callo friabile da foglie di piante micropropagate di patata indotto da 2,4D

11 Callo friabile da embrioni immaturi di mais (1-2 mm) indotto da 1 mg l -1 2,4D Callo friabile di Arabidopsis thaliana

12 Inoculo nel mezzo di coltura 1.trasferire pezzi di callo friabile in mezzo di coltura liquido (Heller, B5 Gamborg, MS, etc.); 2.agitare per isolare le cellule nel mezzo. Nel caso non sia disponibile callo friabile, allora mettere in coltura liquida anche il callo compatto e porzioni di tessuto; dopo circa una settimana, prelevare con una pipetta a bocca larga solo cellule, singole e piccoli gruppi (clumps), eliminando pezzi di tessuto grossolani e porzioni grandi di callo, ed inoculare in mezzo fresco. Successive risospensioni consentiranno di ottenere una coltura a cellule singole. Per ridurre la presenza di aggregati cellulari, è possibile procedere alla filtrazione attraverso reti di nylon sterile. Inoculo nel mezzo di coltura Semplice apparato per la filtrazione attraverso filtro sintetico sterile (mesh da 150 x 150 µm)

13 Inoculo nel mezzo di coltura Agitatori planetari per beute climatizzato (sinistra), aperto (destra) Inoculo nel mezzo di coltura Bottiglia per colture cellulari e agitatori rotanti multipli

14 Controllo della crescita (eventuale sub-cultura) E necessario procedere al controllo periodico della vitalità e della crescita delle cellule. Vitalità cellulare: colorazioni di campioni con coloranti non vitali (carminio acetico) o vitali (fluoresceina diacetato)! Crescita cellulare: determinazione del volume delle cellule per centrifugazione, per sedimentazione in beuta o in DeLong, per stima con camera contaglobuli per cellule vegetali (Buecher)! Controllo della crescita (eventuale sub-cultura) Beuta DeLong per coltura di cellule e verifica della crescita volumetrica

15 Controllo della crescita (eventuale sub-cultura) Impiego dello stativo per la determinazione del volume totale di sedimentazione di una coltura di cellule vegetali verifica della crescita volumetrica Controllo della crescita (eventuale sub-cultura) Coltura di cellule di pisello

16 Controllo della crescita (eventuale sub-cultura) Coltura di cellule di patata Controllo della crescita (eventuale sub-cultura) Curva di crescita di cellule in continuo con re-inoculo

17 Curve di crescita di cellule di medica da semi dormienti (Dor) e non (NDor) determinate in base al peso secco Principali problemi e differenze delle colture cellulari rispetto quelle batteriche - dimensioni delle cellule vegetali ( µm); - crescita in aggregati (da pochi micrometri a 2 mm); - bassa resistenza alla tensione trasversale dovuta alla presenza della parete ricca in cellulosa, che impedisce di aumentare la velocità di agitazione della soluzione; - il tasso di accrescimento basso (2-3 settimane per una coltura in batch, sino a 2-3 mesi per colture in continuo) impone l adozione di macchinari (pompe, valvole, condutture, etc.) a basso rischio di rottura;

18 Principali problemi e differenze delle colture cellulari rispetto quelle batteriche (cont.) - la viscosità del mezzo di coltura per la presenza di polisaccaridi aumenta con la crescita cellulare: ciò causa cambiamenti dell interfase solido-liquido ancora non del tutto chiariti, che impediscono di standardizzare a priori il modello della coltura in vitro di cellule vegetali; - le cellule crescono in condizioni aerobiche, quindi necessitano di un continuo apporto di ossigeno, non così elevato come per alcune colture aerobiche batteriche, bensì di un flusso regolare e costante (troppo = troppo poco): - è difficile risolvere il problema della formazione di schiuma con normali tensioattivi, come nelle colture batteriche. Volume totale di cellule (PCV) di Cyclamen persicum a vari giorni di coltura a differenti concentrazioni di ossigeno

19 Variazione del ph a vari giorni di coltura di cellule di Cyclamen persicum a differenti concentrazioni di ossigeno

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