Applicazione della coltura in vitro per la Salvaguardia di Gentiana pneumonanthe

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1 ISTITUTO ISTRUZIONE SUPERIORE L. CASTIGLIONI Via Garibaldi, 115 LIMBIATE (MB) Applicazione della coltura in vitro per la Salvaguardia di Gentiana pneumonanthe Filippa Puglisi Rosalia Mantegazza

2 Biodiversità a Scuola Tutela e Salvaguardia del Territorio Contenuti Premessa Protocolli riproduzione in vitro di Gentiana pneumonanthe Risultati Osservazioni Conclusioni

3 Raccolta Moltiplicazione Conservazione Parco delle Groane Solaro

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5 Gentiana pneumonanthe (Fam. Gentianaceae) Epoca fioritura: VII-IX Provenienza: Brughiera Parco Groane C1-rara IUCN Simbiosi con Maculinea alcon

6 Habitat di brughiera e prati umidi

7 Maculinea alcon depone le uova solo sul fiore di Gentiana pneunonanthe Myrmica scabrinodis accudisce la larva di Maculinea permettendole di giungere a maturità

8 Inizio lavori dicembre 2012 Difficoltà Dimensioni dei semi Poca letteratura N 500 semi Valore germinazione ottenuto: 1,2%

9 Esperienze condotte Testati differenti protocolli di sterilizzazione PPM al 2% h NaClO 2,5 e 4,5% da 6 a 12 minuti Differenti mezzi nutritivi : M&S - Macro LP WPM Differenti fitoregolatori di crescita a differente dosaggio BAP - IBA - GA3 - IAA KIN 2iP Condizioni di Crescita: Vernalizzazione 4 C per 1 e 2 mesi Camera di crescita 24,5 C - Fotoperiodo h 16 luce h 8 buio Differenti ormoni radicanti nel passaggio in vivo NAA - GA3 - IBA

10 Esperienze di Laboratorio PPM 2% - h 2 LV1 NaClO 12 min

11 Anno di raccolta semi 2014 N 2000 semi in coltura N 1082 semi germinati N 800 piante ambientate

12 Le variazioni climatiche ambientali influenzano in maniera significativa il grado di germinabilità dei semi Determinando pertanto i valori di germinazioni ottenibili con le tecniche in vitro Osservati valori differenti di germinazione in base: all andamento stagionale - riferito all anno di raccolta semi al sito di provenienza dei semi All interno di campioni provenienti dalla stessa popolazione Con i protocolli in uso i valori di germinazione oscillano dal 17 al 36% Per la raccolta dei dati testati n 5000 semi - Anno raccolta

13 Protocolli Relativi alle Fasi di Riproduzione in Vitro STERILIZZAZIONE DEI SEMI MEZZI NUTRITIVI TECNICA AMBIENTAMENTO

14 Disinfezione semi Ipoclorito di Sodio 2,5% per 8-9 min 4,5% per 9 min

15 Disinfezione semi e messa in coltura

16 Risultati - Osservazioni Ipoclorito di Sodio 2,5% per 8-9 min 4,5% per 9 min 85% materiale asettico 100% materiale asettico 54% semi germinati in mezzo nutritivo LV1 30% semi germinati in mezzo nutritivo LV1

17 Camera di Crescita 24,5 C Fotoperiodo 16 h luce 8 h buio

18 Camera di crescita

19 Mezzo nutritivo per coltura semi LV 1 M&S ½ MioInositolo Tiamina IBA Saccarosio Agar 2313,96 mg\l 50 mg\l 0,5 mg\l 0,01 mg\l 15 g\l 6,5 g\l ph 5.8 Ciclo Sterilizzazione 120 C x 20 minuti

20 Risultati - osservazioni LV 1 - coltura semi M&S 2313,96 mg\l MioInositolo 50 mg\l Tiamina 0,5 mg\l IBA 0,01 mg\l Saccarosio 15 g\l Agar 6,5 g\l ph 5.8 IBA ha favorito germinazione semi Tempi di risposta rapidi Plantule visibili dopo 8/12 gg MS ½ permesso crescita plantule Germinazione 54% (con NaClO 2,5%)

21 Osservazione semi al microscopio Secondo giorno dalla mesa in coltura

22 Terzo giorno

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24 Trasferimento in linfa -box

25 Composti LV2 LV1 Macro+Micro M&S 4.627,93 mg\l 2313,96 mg/l MioInositolo 100 mg\l 50 Tiamina 1 mg\l 0,5 IBA 0,02 mg\l 0,01 Saccarosio 30 g\l 15 g\l Agar 6,5 g\l 6,5 g\l ph Ciclo Sterilizzazione 120 C x 20 minuti

26 Risultati - osservazioni LV 2 sviluppo - radicazione Composti MS 4.627,93 mg\l MioInositolo 100 mg\l Tiamina 1 mg\l IBA 0,02 mg\l Saccarosio 30 g\l Agar 6,5 g\l ph 5.8 Favorito Sviluppo piante Aumento capacità rizogena Incremento n piante ambientate *Trasf. in linfabox: dopo 1 mese dalla messa in coltura

27 LV 1 - coltura semi Composti M&S 2313,96 mg\l MioInositolo 50 mg\l Tiamina 0,5 mg\l IBA 0,01 mg\l Saccarosio 15 g\l Agar 6,5 g\l ph 5.8 LV 2 sviluppo - radicazione Composti MS 4.627,93 mg\l MioInositolo 100 mg\l Tiamina 1 mg\l IBA 0,02 mg\l Saccarosio 30 g\l Agar 6,5 g\l ph 5.8

28 Ambientamento

29 Passaggio in vivo 2-4 mesi successivi alla coltura dei semi Piante sviluppate in LV2 Assenza di ormoni radicanti Pulizia delle radici dal terreno di coltura

30 1 Fase Passaggio in vivo Alveoli Ø 4/6 cm Terriccio di semina 67% Torba acida di sfagno 33% Agriperlite Miniserre In serra di ambientamento periodo favorevole al passaggio da ottobre ad aprile Nebulizzazione quotidiana

31 2 Fase Ambientamento esterno in luogo ombreggiato da marzo a maggio e da settembre a fine ottobre garantendo un buon apporto idrico Risultati: Piante Ambientate 70%

32 Osservazioni Nella fase di ambientamento all esterno si è potuto osservare: la scomparsa della parte aerea mentre le radici hanno continuano a svilupparsi per dare origini a nuovi germogli nella stagione successiva.

33 Osservazioni Le Gentiane prodotte in vitro possono fiorire dopo appena due settimane dal passaggio in vivo per riprendere il ciclo naturale dopo il primo inverno trascorso all esterno. Da semi raccolti dalle piante ottenute in vitro Buona germinabilità in vivo Crescita lenta

34 Criticità Piante non Ambientate 25% delle Gentiane non supera il passaggio in vivo nei primi 2-3 mesi 5% nei 4-5 mesi successivi

35 Non richieste cure colturali particolari Non necessitano concimazioni

36 Ciclo riproduzione in vitro di Gentiana pneumonanthe 4/6 mesi

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38 Novembre 2016 Aiuola di monitoraggio Marzo 2017 Tutte le Gentiane hanno superato l ambientamento in pieno campo (100%) Possiamo completare la piantumazione per la conservazione della specie

39 Gennaio 2015 Avvio Progetto «FraGenziane»

40 Habitat di brughiera Ripopolamento e Reintroduzione 5000 piante di Gentiana pneumonanthe Parco delle Groane

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42 Ripopolamento Gentiana pneumonanthe Brughiera «Marcellino» - Parco delle Groane Limbiate 28/10/2016

43 Il 93% delle Gentiane piantumate in Brughiera ha superato il primo inverno

44 Il coinvolgimento degli studenti nelle diverse tappe inerenti al progetto

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46 Raccolta Moltiplicazione Conservazione della specie per la Tutela e Salvaguardia del Territorio Obiettivi raggiunti Fioritura e produzione semi in vitro

47 ISTITUTO ISTRUZIONE SUPERIORE LUIGI CASTIGLIONI Via Garibaldi, 115 LIMBIATE (MB) Grazie per la vostra attenzione Grazie Dott.ssa M. Costanza Scarpini Dirigente Scolastico I.I.S. «L. Castiglioni» Grazie Prof.ssa Rosalia Mantegazza Insegnante di Biologia I.I.S. «L. Castiglioni» Filippa Puglisi