Convegno VitroSOI2017 Pescia, maggio 2017

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1 Convegno VitroSOI2017 Pescia, maggio 2017 MIGLIORAMENTI DELLE TECNICHE DI MICROPROPAGAZIONE DELLA NOCCIOLA TONDA GENTILE TRILOBATA Dr. Cappelli Riccardo Prof. Moreno Toselli Dr. Giorgio De Paoli

2 Il nocciolo: scenari attuali Negli ultimi anni l interesse per la coltura del nocciolo è cresciuto notevolmente per vari motivi, tra cui: Necessità di rinnovare il comparto frutticolo per una ormai cronica crisi economica delle specie tradizionali; Interesse dell'industria dolciaria verso questa specie; Capacità del nocciolo di adattarsi ai diversi suoli della penisola italiana.

3 Il nocciolo: scenari futuri Possibilità di un buon profitto per le aziende vivaistiche; Necessità di una filiera garantita, di qualità, trasparente e certificata, dalla gestione della pianta madre al prodotto finale; Fondamentale investire nella creazione di campi di piante madri e nella micropropagazione, valido strumento per la propagazione del nocciolo in ambiente controllato.

4 Tonda gentile trilobata La Tonda Gentile Trilobata (TGT) è la varietà principalmente coltivata in Piemonte con la denominazione Nocciola Piemonte I.G.P. Questa nocciola si contraddistingue per le sue caratteristiche strutturali e per i suoi parametri qualitativi e organolettici. Fra queste: - la buona resa allo sgusciato; - la buona forma (tonda), il guscio sottile ed il perisperma con spessore ridotto: - tali qualità risultano importanti per la sgusciatura e la resa; - la facilità di pelatura dopo la tostatura; - il seme dotato di buon aroma e di sapore delicato; - il tenore dei grassi limitato.

5 Potenzialità della micropropagazione Potenzialità della micropropagazione del nocciolo del nocciolo Maggiore velocità nella produzione di piante. La micropropagazione, rispetto ai metodi tradizionali, potrebbe essere una valida alternativa per l'ottenimento di un gran numero di piantine in uno spazio ristretto e in un tempo minore. Origine conosciuta e uniformità genetica delle piante prodotte. Succede spesso che i polloni presi per la moltiplicazione e la costituzione di nuovi impianti siano miscele di varietà creando così un'offerta di nocciole eterogenea non consona all'industria di trasformazione. Garanzia di sanità. Infine con la micropropagazione è possibile produrre materiale sano, virus-esente e uniforme dal punto di vista genetico, caratteristiche che oggi sono imprescindibili per una filiera controllata e tutelata.

6 Aspetti critici della micropropagazione Aspetti critici della micropropagazione del nocciolo Micropropagazione del nocciolo: una tecnica sicuramente promettente ma che presenta ancora margini di miglioramento. Sono diversi gli aspetti critici: Comportamento recalcitrante della specie (scarsa attitudine del materiale ad adattarsi alle condizioni artificiali in vitro). Scarsa conoscenza delle giuste condizioni e metodi colturali e ambientali.

7 Aspetti critici della micropropagazione del nocciolo Scopo del lavoro Il proposito di migliorare la tecnica della micropropagazione della cultivar Tonda Gentile Trilobata è stata la spinta per questo lavoro, svoltosi presso il laboratorio di micropropagazione della Dalmonte Micro s.s. di Faenza, con l aiuto dell esperto di micropropagazione Giorgio de Paoli. L obiettivo è stato la messa a punto di un mezzo di crescita degli espianti in grado di garantire la completa sterilità, la reattività della cultivar a produrre microtalee di nocciolo omogenee in grado di accrescersi rapidamente. In particolare sono stati confrontati 8 tipi di substrato, valutando la reazione, la crescita e lo sviluppo dei germogli.

8 Aspetti critici della micropropagazione del nocciolo MATERIALI Scopo del E lavoro METODI Scelta del materiale Gli espianti iniziali sono stati eseguiti su piante madri conservate presso il repositorio del CAV (Centro Attività Vivaistica) di Tebano. Tale materiale presenta una maggiore possibilità di ottenere colture sterili e reattive alla coltura in vitro. Infatti la limitazione del nocciolo alla coltura in vitro è attribuibile anche alla elevata contaminazione di partenza del materiale.

9 Materiali Scopo del e lavoro Metodi MATERIALI E METODI: Componenti dei substrati di tesi Rispetto al nostro substrato di riferimento, il DKW (Driver and Kuniyuki, 1984), sono stati modificati alcuni componenti: Apporto di Fe: 4 substrati (A, D, E, H) presentavano solo il Fe-EDTA. Gli altri quattro terreni (B, C, F, G) presentavano una miscela tra il Fe-EDDHA (Sequestrene 138) e il Fe-EDTA. Apporto delle citochinine BAP e 2iP:Si è voluto valutare se il BAP potesse offrire risultati migliori rispetto al 2iP. Nei terreni A, B, C, D è stato aggiunto l ormone BAP e nei substrati E, F, G, H è stato aggiunto il 2iP. Confronto tra presenza e assenza del thidizuron (TDZ): Il TDZ è stato aggiunto in 4 terreni (C, D, G, H). Apporto delle vitamine: Sono state utilizzate la tiamina, piridossina e niacina, vitamine tipiche del mezzo MS (Murashige and Skoog, 1962). Componenti NM. A NM. B NM. C NM. D NM. E NM. F NM. G NM. H Chelati: Fe-EDTA 65,10 32,55 32,55 65,10 65,10 32,55 32,55 65,10 Sequestrene 138 (FeNK) mg/l 0,00 65,10 65,10 0,00 0,00 65,10 65,10 0,00 Vitamine MS MS MS MS MS MS MS MS Auxine NAA 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 Citochinina BAP 1,50 1,50 1,50 1,50 Citochinina 2ip 1,50 1,50 1,50 1,50 TDZ mg/l 0,10 0,10 0,10 0,10

10 MATERIALI Materiali Scopo del e E lavoro Metodi METODI Preparazione substrati: la preparazione degli 8 terreni è iniziata a metà marzo e si è conclusa con la preparazione delle provette per gli espianti.

11 MATERIALI E METODI Materiali Scopo del e lavoro Metodi Prelievi delle gemme di nocciolo: I prelievi delle gemme della cultivar Tonda Gentile delle Langhe, sono stati eseguiti attorno alla metà di maggio.

12 Primo rilievo MATERIALI E METODI Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Substrato N. Espianti N. Espianti N. Espianti N. Espianti in Note iniziali Contaminati da contaminati da sterili crescita funghi batteri A B C D E F germoglio necrotizzato G H

13 MATERIALI E METODI Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Primo rilievo: Si sono sviluppate contaminazione su almeno la metà degli espianti per ogni substrato, con delle punte superiore al 60% per i terreni A, E ed H. Si è osservato come il tipo di contaminazione sia stata principalmente fungina.

14 MATERIALI E METODI Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Secondo rilievo: Emersa l'assenza di gemme schiuse si è deciso allora di spostare le gemme in provette più grandi (con diametro di 2,5 cm), per garantire un maggiore spazio per lo sviluppo del germoglio e una maggiore disponibilità di aria, acqua e nutrienti.

15 MATERIALI E METODI Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Terzo rilievo: Al 17 di giugno ancora nessuna gemma presenta segni di germogliamento, mentre c è ancora la presenza di contaminazioni fungine e batteriche. In particolare nel substrato A la contaminazione è attorno all 87%. Substrato N. Espianti N. Espianti N. Espianti N. Espianti in iniziali Contaminati contaminati da sterili crescita da funghi batteri A B C D E F G H

16 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Quarto rilievo: Al 7 luglio sono state osservate le prime gemme che hanno iniziato ad ingrossarsi o a dare vita a un germoglio. Substrato a Germogli Germogli Ferme Ingrossate Sbocciate legno con 3 Fiorali Morti Vivi totali foglie A 1 1 / / / / 2 B 2 2 / / / / 4 C / / / 7 D 1 / 1 2 / / 4 E 1 / / / 2 2 necrotici 3 F / 4 / / 1 / 5 G / 1 2 / 1 1 fiore 4 femminile necrotico H / / / 5

17 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Quarto rilievo: L analisi visiva ha evidenziato un numero di gemme germogliate di 17, 8 delle quali appena schiuse e non ancora distinguibili se a legno o a fiore, 4 a legno con 3 foglie e infine 5 a fiore.

18 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Indagini statistiche sui confronti dei composti: Confronto tra i chelati Fe-EDTA e il mix di Fe-EDTA e Sequestrene 138 Componente Chelati Fe-EDTA (terreni A, D, E, H) Mix Fe-EDTA e Fe- Sequestrene (terreni B, C, F, G) ferme o ingrossate Germogli morti solo sbocciate a legno con 3 foglie a fiore Totale Espianti Germogliati 1 0,5 1 0,75 0,75 3,5 3,25 0,25 1 0,25 0,5 5

19 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Indagini statistiche sui confronti dei composti: Confronto tra le citochinine BAP e 2iP Componente Germogli solo a a Totale ferme o morti sbocciate legno con 3 fiore Espianti ingrossate foglie Germogliati BAP (terreni A, B, C, D) 2iP (terreni E, F, G, H) 2,75 0 0,75 0,75 0 4,25 1,50 0,75 1,25 0,25 1,25 4,25

20 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Indagini statistiche sui confronti dei composti: Effetti della presenza o meno della citochinina TDZ nei terreni TDZ Presente ingrossate Germogli morti solo sbocciate a legno (3 foglie) a fiore Totale Espianti Germogliati 1,5 0,25 2,0 1,0 0,5 5,0 (C, D, G, H) Assente 2,75 0, ,75 0,5 (A, B, E, F)

21 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Quinto rilievo: Al 13 luglio le contaminazioni si erano esaurite. Le morti dovuti a squilibri nutrizionali, sono risultate limitati e hanno inciso per la maggior parte sulle gemme più piccole e deboli. I risultati migliori continuano ad essere in presenza del TDZ. Substrato Ferme Ingrossate Sbocciate a legno con 3 foglie Fiorali Germogli Morti Germogli Vivi Totali A 1 1 / / / / 2 B 2 / / / / 2 2 C / 1 4 / / 7 D / / 1 2 / 1 necrotico 3 E 1 / / necrotici 3 F / 3 / / 1 1 contaminato 4 G / 1 2 / 1 1 fiore femminile necrotico H / / / 5 4

22 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Sesto rilievo: Situazione dei germogli e gemme in provette Substrato e Germogli vivi Ferma Ingrossate Sbocciate Fiorali Germogli totali morti/necrotici C / 3 3 / 2 6 D / 1 2 / / 3 G / 3 3 / 2 6 H / 1 2 / 1 3 Situazione dei germogli e gemme in vaschette Substrato Germogli con Germogli con Germogli con Germogli Germogli sviluppo foglie arricciate foglie contaminati totali normale clorotiche C 1 / / 1 2 D 1 1 / / 2 G / / / / / H / 4

23 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro L effetto del TDZ si è manifestato sullo sviluppo delle gemme, infatti quasi il 60% di quelle vive è sbocciato (il 45% delle gemme totali) e ha iniziato a generare un germoglio; mentre le altre, non ancora schiuse, presentavano già uno sviluppo significativo in larghezza grazie all influsso ormonale. Ecco la situazione in vaschetta e provetta:

24 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Settimo rilievo: La quasi la totalità delle gemme si era schiusa (circa il 78% del totale delle espianti rimasti) producendo piccoli germogli in tutti e 4 i substrati. La maggioranza dei germogli si presentava con una morfologia vegetale dall aspetto sofferente o clorotico. Un fattore di questa morfologia è dato anche dalla presenza del TDZ.

25 Scopo RISULTATI Risultati del lavoro Ottavo controllo: Il 14 ottobre si è svolta l ultima osservazione delle piantine di nocciolo nell unico terreno rimasto dove le piantine avevano in generale conservato caratteristiche positive osservate nel rilievo precedente Substrato Germogli in espansione e con sviluppo conforme Germogli con foglie clorotiche o non conforme Germogli contaminati Germogli necrotizzati Germogli vivi totali D 11 9 / 1 21

26 DISCUSSIONI Discussioni Scopo del E e CONCLUSIONI Conclusioni lavoro Aspetti importanti da considerare: Crescita lenta e difficile dei germogli. In generale, infatti dopo 9 mesi dal trapianto, i germogli si presentavano ancora piccoli e fragili, confermando la grande difficoltà di adattamento del nocciolo alla coltura in vitro. Germogliamento delle gemme degli espianti. Si è arrivati alla germogliazione della Tonda Gentile Trilobata grazie a una corretta combinazione di ormoni, in particolar modo grazie alla citochinina TDZ. Qualità delle piantine: la combinazione ormonale che ha dato i risultati migliori è stata la miscela di citochinine BAP e TDZ, che ha prodotto piantine più sane e rigogliose rispetto ai terreni che presentavano la miscela 2iP e TDZ. In questo studio la BAP ha portato risultati migliori rispetto alla 2iP. Sterilità degli espianti: l utilizzo di piante di partenza allevate in repositori controllati e sicuri come quello dei centri di moltiplicazione di materiale di base e pre-base ha portato ha contrastato le intense contaminazioni iniziale.

27 DISCUSSIONI Discussioni Scopo del E e CONCLUSIONI Conclusioni lavoro Prospettive future Lo studio potrebbe continuare, presso i laboratorio della Dalmonte Micro, al fine di valutare le fasi successive dello sviluppo delle piantine in vitro, come la fase di moltiplicazione e radicamento, trovando i giusti substrati per aiutare la pianta a formarsi rapidamente.

28 GRAZIE PER L ATTENZIONE