Valutazione degli effetti su sistemi in vitro di UFPs (ultrafine particles) derivate da processi di combustione

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1 Valutazione degli effetti su sistemi in vitro di UFPs (ultrafine particles) derivate da processi di combustione M. Gualtieri 1, L. Capasso 1, L. Isacco 1, P. Minutolo 2, A. D Anna 3, M. Camatini 1 1 Centro di Ricerca POLARIS, Università degli studi di Milano Bicocca 2 Istituto di Ricerche sulla Combustione, CNR, Napoli 3 Università Federico II di Napoli

2 Introduzione exhaust particles (DEP) Il DEP contiene diverse frazioni: 1) Soot particelle sferiche carboniose, ricoperte da sostanze organiche ed inorganiche 2) SOF (soluble organic fraction) frazione organica (n alcani, acidi n alcanoici con una presenza rilevante di IPA, IPA ossidati, acido benzoico, opani e sterani) 3) Particelle secondarie generate dall ossidazione di zolfo organico presente nel combustibile 1 2 Molecole organiche in fase vapore possono formare aggregati di dimensioni nanometriche (d= 1 3 nm) NOC 3 Twigg et al, 2009

3 Obiettivi Analizzare gli effetti di nanoparticelle di carbonio organico (NOC), prodotte da processi di combustione controllata, su sistemi in vitro rappresentativi degli epiteli polmonari umani Verificare se la composizione chimica del combustibile influenza il potenziale tossico delle NOC Scopo BEAS 2B cellule bronchiolari A549 pneumociti di II tipo Endpoints Caratterizzazione delle NOC: indagini spettrofotometriche e spettrofluorimetriche Citotossicità: saggio MTT per A549, AlamarBlue per BEAS 2B, Hoechst/PI Risposta infiammatoria (rilascio di IL 6 e IL 8): ELISA Formazione di specie reattive dell ossigeno (ROS): citometria a flusso Ciclo cellulare: citometria a flusso

4 Materiali e Metodi Nanoparticelle di carbonio organico (NOC) Il sistema di campionamento, basato sulla condensazione dell acqua contenuta nei fumi di scarico, evita l aggregazione delle particelle. N 2 condenser La caratterizzazione dimensionale è stata realizzata con un misuratore di mobilità (Dynamic Mobility Analyzer) Motore diesel con FAP / Burner

5 Trattamenti I campioni di NOC sono stati ottenuti a partire da combustione di diesel classico o addittivato con: idrocarburi composti di sintesi Combustibile classico classico + alchil benzene classico + naftalene classico + naftene Materiali e Metodi Acronimo D+Alchil Benz D+Naftalene D+Naftene classico + estere monoalchilico di acidi grassi Biodiesel classico + composti di sintesi classico + composti di sintesi D+C1 D+C2 Durata trattamento Concentrazioni Vitalità cellulare 24 h 1, 3, 7 ppm Risposta infiammatoria 24 h 1, 3, 7 ppm curve dose/risposta ROS 90 min 3 ppm Ciclo cellulare 24 h 3 ppm

6 Risultati Caratterizzazione dei campioni Analisi spettrofotometriche Analisi spettrofluorimetriche A Intensità nm Gli spettri presentano un picco nell UV intorno a 200 nm, corrispondente alla natura organica delle nanoparticelle (200 < λ < 300 nm è tipica dei legami C C presenti nelle molecole aromatiche) nm Quattro picchi a lunghezza d onda di: 270 nm attribuibile allo spettro di eccitazione 295 nm 1 anello benzenico 310 nm 2 anelli benzenici 410 nm 3 e 4 anelli benzenici

7 Vitalità cellulare Vability (fold increase) 1,2 D+Alchil Benz D+Naftalene D+Naftene Biodiesel NOC NOC 1 ppm 3 ppm 7 ppm statisticamente differente dal controllo (ANOVA, p<0.05) A549 D+C1 D+C2 Vability (fold increase) 1,2 Le NOC prodotte da diesel con additivi risultano più tossiche di quelle ottenute da combustibile diesel classico D+Alchil Benz 1 ppm 3 ppm 7 ppm D+Naftene Biodiesel D+C1 D+C2 NOC Risultati BEAS 2B

8 Vitalità cellulare: curve dose/risposta A549 increase) D+Alchil Benz 1,4 1,2 1,4 1, Biodiesel Risultati statisticamente differente dal controllo (ANOVA, p<0.05) 1,4 1, ,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25 2,5 2,75 3 campione D+AlcB Biodiesel IC ppm 6 ppm 1.1 ppm

9 Risultati Vitalità cellulare: curve dose/risposta BEAS 2B 1,2 D+Alchil Benz 1,2 1,2 Biodiesel NOC statisticamente differente dal controllo (ANOVA, p<0.05) statisticamente differente dal controllo (ANOVA, p<0.05) Campione D+AlcB Biodiesel IC50 > 7 ppm 3.6 ppm 0.94 ppm ,5 0,75 1 1,25 1,5

10 Risultati Risposta Infiammatoria (IL 6) IL-6 (fold increase) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1 ppm 3 ppm 7 ppm A549 Tutte i campioni testati inducono il rilascio di mediatori dell infiammazione (IL 6) D+Alchil Benz D+Naftalene D+Naftene Biodiesel D+C1 statisticamente differente dal controllo (ANOVA, p<0.05) IL-6 IL-6 (fold (fold increase) D+C2 5,0 4,0 3,0 2,0 1 ppm 3 ppm 7 ppm D+Alchil Benz BEAS 2B D+Naftene Biodiesel D+C1 D+C2

11 Risultati Rilascio IL 6: curve dose/risposta A594 D+Alchil Benz 1,4 1,2 Biodiesel 1,4 1,2 Viability IL ,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 Vability IL-6 16,0 14, ,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25 2,5 2, ,0 1 8,0 6,0 4,0 2,0 IL-6 (fold increase) IL-6 (fold increase) IL-6 (fold increase) IL-6 (fold increase) 1,4 1,2 Vability statisticamente differente dal controllo (ANOVA, p<0.05) Le NOC ottenute da addittivato inducono un maggior rilascio di interleuchine, non dosedipendente In particolare per le NOC ottenute da D+Alchil Benz la risposta è correlabile alla citotossicità (necrosi cellulare) IL-6 12,0 1 8,0 6,0 4,0 2,0 IL-6 (fold increase) IL-6 (fold increase)

12 Risultati Rilascio ROS 4 A549 3 ROS (u.a.) ROS (u.a.) 2 A 90 min di esposizione con 3ppm di NOC non c è rilascio di ROS 1 0 Non trattato D+Alchil Benz D+Nafteni D+C1 Ctrl D+Alchil D+naftene D+C1 Benz statisticamente differente dal controllo (ANOVA, p<0.05) BEAS 2B Il rilascio di ROS è significativo per tutte le NOC impiegate ROS (u.a.) ROS (u.a.) Non trattato D+Alchil Benz D+Nafteni D+C1 Ctrl D+Alchil D+naftene D+C1 Benz

13 Risultati Ciclo cellulare 70 Non trattato D+Alchil Benz D+Nafteni D+C1 Cells percentage % cellule (%) A549 A 24 h di trattamento con 3 ppm tutte le NOC inducono un incremento di cellule in fase G2/M Sub Sub G0 G0 G1 S G2/M statisticamente differente dal controllo (ANOVA, p<0.01) 70 Non trattato D+Alchil Benz D+Nafteni D+C1 BEAS 2B A 24 h di trattamento con 3 ppm tutte le NOC inducono un incremento di cellule in fase G1 e un decremento in fase S Cells percentage (%) % cellule Sub Sub G0 G0 G1 S G2/M

14 Conclusioni Conclusioni Tutte le NOC ottenute da combustibili diesel classico o diesel addittivati inducono citotossicità e infiammazione nelle due linee cellulari I diesel con addittivi inducono tossicità maggiore rispetto al diesel classico Il Biodiesel produce la tossicità più elevata

15 Conclusioni La ricerca è stata finanziata dal MIUR nel progetto PRIN08: Valutazione degli effetti di particelle ultrafini derivate da combustione su sitemi in vitro ed in vivo. Grazie per l attenzione laura.capasso@unimib.it