Progetto di Ricerca. 1) la capacità dei cheratinociti umani di internalizzare il nanoparticolato

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1 Progetto di Ricerca Studio del potenziale pro-infiammatorio e pro-fibrotico del particolato ambientale (nanoparticelle da gas di scarico di motori diesel) nella Sclerosi Sistemica *Silvana Fiorito, *Felice Salsano, **Gianfranco Ferraccioli * Università di Roma, Dipartimento di Medicina Clinica-Unità di Immunologia Clinica:Centro per lo Studio della Sclerodermia **Università Cattolica del Sacro Cuore-Policlinico Gemelli, Divisione di Reumatologia, Roma Nell ambito di tale progetto il nostro gruppo (S. Fiorito e F. Salsano, Università di Roma, Dipartimento di Medicina Clinica-Unità di Immunologia Clinica:Centro per lo Studio della Sclerodermia) in collaborazione con i colleghi del Laboratorio di Fisiopatologia cutanea dell Istituto Dermatologico San Gallicano di Roma ha effettuato uno studio preliminare degli effetti delle nanoparticelle provenienti dai gas di scarico di due tipi di motori diesel su cellule cutanee umane (cheratinociti e fibroblasti) in cultura primaria. Nostro obbiettivo è quello di verificare se tale nanoparticolato possa essere citotossico e avere effetti pro-infiammatori nei riguardi di tali cellule e se, come da noi ipotizzato, la risposta infiammatoria cellulare al nanoparticolato ambientale possa indurre un processo a cascata responsabile del successivo sviluppo di reazione fibrotica da parte dei fibroblasti in malattie infiammatorie croniche, come la Sclerosi Sistemica, nelle quali la fibrosi ha un ruolo preponderante. Risultati preliminari (Novembre 2010): - Sono stati valutati gli effetti tossici e pro-infiammatori di nanoparticelle di carbonio provenienti dai gas di scarico di due tipi di motori diesel: di nuova (Euro IV) e di vecchia generazione su cellule cutanee umane in vitro. Tali nanoparticelle erano state precedentemente caratterizzate dal punto di vista fisico-chimico utilizzando microscopia elettronica ad alta risoluzione, esame termogravimetrico etc. - I tests di citotossicità sono stati effettuati su cheratinociti e fibroblasti umani provenienti da cute di soggetti normali, in cultura primaria. - Sono stati valutati: 1) la capacità dei cheratinociti umani di internalizzare il nanoparticolato 2) la citotossicità del nanoparticolato (mediante valutazione della vitalità cellulare con test del trypan blu) nei riguardi di cheratinociti e fibroblasti cutanei 3) il potenziale pro-infiammatorio del nanoparticolato (mediante la valutazione del rilascio e dell espressione genica delle principali citochine infiammatorie- IL-1α, Il6, Il-8, TNF- α) nei riguardi dei cheratinociti cutanei 4) la capacità del nanoparticolato di indurre stress ossidativo cellulare (mediante la misurazione dell produzione di specie reattive dell ossigeno ROS- intracellulari) nei cheratinociti cutanei

2 5) la capacità del nanoparticolato di stimolare nei cheratinociti la produzione di molecole anti-ossidanti (mediante la misurazione dell espressione genica delle molecole Nrf2 e emossigenasi- 1) 6) il potenziale pro-infiammatorio del nanoparticolato nei riguardi di fibroblasti cutanei normali (mediante la valutazione della secrezione delle metalloproteasi: MMP-3 e MMP-9 secrete dai fibroblasti stimolati col nanoparticolato. I risultati ottenuti dal nostro studio hanno dimostrato che: 1) tutti e due i tipi di nanoparticolato sono internalizzati spontaneamente dai cheratinociti; 2) tutti e due i tipi di nanoparticolato sono citotossici nei riguardi di ambedue le popolazioni cellulari studiate, ma il particolato proveniente da motori diesel di tipo Euro IV ha dimostrato una maggiore citotossicità rispetto a quello proveniente da motori diesel di vecchia concezione; 3) tutti e due i tipi di nanoparticolato sono in grado di indurre aumento significativo della produzione di citochine infiammatorie da parte dei cheratinociti umani in cultura, in modo dosedipendente. E particolarmente importante il riscontro dell aumentata produzione da parte dei cheratinociti di IL-1α, in quanto è proprio attraverso la liberazione e l attività di questa citochina che si può spiegare come, in vivo, possa avvenire l attivazione dei fibroblasti presenti nel derma da parte dei cheratinociti stimolati dal nanoparticolato; 4) tutti e due i tipi di nanoparticolato inducono stress ossidativo in queste cellule, e non sono in grado di indurre da parte delle stesse cellule una concomitante produzione di molecole antiossidanti protettive, capaci di controbilanciare l effetto ossidativo; 5) tutti e due i tipi di nanoparticolato esercitano un effetto pro-infiammatorio anche sui fibroblasti dermici, inducendo una produzione significativa di ambedue le metalloproteasi studiate, ma si è osservato che il nanoparticolato dei motori diesel Euro IV ha un maggiore capacità, rispetto al nanoparticolato dei motori di vecchia generazione, di indurre la produzione delle metalloproteasi MMP-3. La metalloproteasi MMP-3 è più potente dell MMP-9 come attivatore del rilascio di TNFα, e pertanto ha un maggior potere profibrotico ed è più effettiva nello stimolare l attivazione delle cellule endoteliali e il richiamo di linfociti infiltranti. Risultati dello studio effettuato fino a Maggio 2011 In considerazione dei risultati ottenuti nello studio preliminare del nanoparticolato diesel su cellule cutanee umane in cultura primaria (cheratinociti e fibroblasti), abbiamo voluto confermare i dati ottenuti precedentemente utilizzando metodiche più sofisticate. 1) La citotossicità del nanoparticolato (Euro IV ed Euro III) su cheratinociti e fibroblasti è stata valutata ulteriormente utilizzando una metodica diversa dalla precedente: il test di attività metabolica cellulare mediante incorporazione di MTT. Mentre si è osservato che il nanoparticolato Euro III induce in entrambi i tipi cellulari una riduzione del 20% della vitalità cellulare alla dose più elevata (60 µg/ml), per quanto riguarda il particolato Euro IV, nei cheratinociti si è vista una riduzione significativa della vitalità nel 30% delle cellule e nei fibroblasti una riduzione della vitalità significativa nel 40% delle cellule alla dose più elevata (60%). Tali dati confermano la maggiore tossicità su entrambi i tipi cellulari del particolato Euro IV già asservata precedentemente

3 3) L'integrità di membrana dei cheratinociti è stata valutata dopo trattamento delle cellule con il nanoparticolato (Euro IV ed Euro III) mediante saggio di permeabilità al colorante per DNA Hoechst L esame ha mostrato che mentre il nanoparticolato Euro III induce un danno di membrana cellulare nel 20% delle cellule soltanto alla massima concentrazione (60µg/ml), il particolato Euro IV induce un danno della membrana cellulare nel 20% delle cellule alla concentrazione di 30µg/ml e che la percentuale delle cellule danneggiate raddoppia e raggiunge il 40% alla concentrazione superiore di particolato (60µg/ml). Anche questo test conferma la maggiore tossicità del particolato Euro IV 2) La valutazione dell internalizzazione del particolato da parte dei cheratinociti è stata effettuata anche mediante la microscopia confocale (microscopio LEICA TCS SP5) ed effettuando sezioni confocali orizzontali e verticali allo scopo di ottenere una visualizzazione in due proiezioni delle cellule, e potere cosi osservare la effettiva internalizzazione delle nanoparticelle e distinguere quelle adese alla superficie cellulare esterna da quelle intracitoplasmatiche. Questa osservazione ci ha permesso non solo di confermare le osservazioni precedenti indicanti che il particolato viene internalizzato dai cheratinociti spontaneamente, ma che la quantità di particolato diesel Euro 4 internalizzato e presente in sede intracitoplasmatica è di molto superiore a quella del particolato Euro III. Abbiamo inoltre osservato che il particolato di dimensioni inferiori (Euro VI) penetra anche all interno del nucleo cellulare. Riteniamo che tale ultima osservazione sia di importanza fondamentale per i successivi sviluppi della ricerca. Risultati dello studio (Ottobre 2011) 1) Valutazione degli effetti pro-ossidanti del particolato. Poichè è stato dimostrato che il particolato diesel induce stress ossidativo, abbiamo analizzato la produzione intracellulare di specie reattive dell ossigeno (ROS) da parte delle cellule cutanee normali in studio dopo esposizione al particolato Euro IV ed Euro III. Ambedue i tipi di particelle inducevano un significativo aumento della produzione di ROS in maniera dose-dipendente dopo soltanto 1 h di esposizione. I livelli di ROS erano significativamente più alti nelle cellule trattate con particolato Euro IV in confronto con l Euro III. Inoltre, poichè la capacità pro-ossidativa indotta da qualsivoglia stimolo è usualmente controbilanciata dai processi anti-ossidativi indotti dai sistemi di difesa cellulari, abbiamo anche valutato le capacità anti-ossidanti delle cellule esposte al particolato analizzando l espressione genica di Nrf-2, un fattore chiave di trascrizione, che regola l espressione della molecola anti-ossidante HO-1. Tale molecola ha un ruolo importante come proteina anti-stress con funzioni citoprotettive. I nostri risultati hanno mostrato che ambedue le nanoparticelle diesel sono capaci di indurre l espressione di mrna-nrf-2 dopo 3 e 6 h di esposizione delle cellule, ma mentre le particelle Euro III inducono tale espressione in maniera dose-dipendente, l espressione di Nrf-2 mrna diminuisce quando le cellule sono esposte alla dose maggiore di particelle Euro IV. Una tendenza simile è stata osservata per l espressione di HO-1 mrna dopo 6 h di esposizione. Il nanoparticolato Euro IV alle concentrazioni più alte (60µg/ml), sembra indurre effetti pro-ossidanti nei cheratinociti maggiori di quelli indotti dal nanoparticolato proveniente da motori diesel Euro III. I nostri risultati, quindi, hanno mostrato che, mentre ambedue i tipi di nanoparticolato inducono un significativo aumento di molecole ossidanti (ROS) dopo soltanto 1 h di trattamento e in maniera dose-dipendente, i cheratinociti esposti alle particelle Euro

4 IV producono livelli più elevati di ROS non controbilanciati da un efficace risposta anti-ossidante cellulare. L incapacità delle cellule a generare meccanismi anti-ossidanti in risposta al particolato può spiegare i più pronunciati effetti citotossici esercitati da tali particelle. 2) Valutazione degli effetti pro-infiammatori del particolato. Abbiamo inoltre valuatato il potenziale pro-infiammatorio delle stesse nanoparticelle misurando l induzione dell espressione da parte dei cheratinociti dell mrna delle interleuchine: IL- 1α, IL-6, IL-8 and TNF-α mediante Real time RT-PCR. Il trattamento delle cellule con particolato Euro III ha indotto aumento significativo dei livelli di tutte le citochine studiate in amaniera dose-dipendente, mentre il trattamento con il particolato Euro IV ha indotto una minore modulazione dell mrna di tali citochine. Il dosaggio delle stesse interleuchine nei sovranatanti delle culture cellulari delle stesse cellule ha mostrato un marcato e maggiore incremento dei livelli di tutte le citochine esaminate nei sovranatanti delle cellule esposte al particolato Euro III rispetto a quelli indotti dall Euro IV. Il più intenso effetto citotossico che è stato osservato essere indotto dalle particelle Euro IV può spiegare tale effetto ridotto sulla produzione di citochine pro-infiammatorie. 3) Valutazione degli effetti pro-fibrogenici del particolato E stato succesivamente esaminato l effetto di ambedue i tipi di particolato sull attivazione di fibroblasti umani normali, misurando il rilascio da parte di tali cellule di due tipi di Metalloproteasi (MMPs): MMP-3 ed MMP-9, molecole che hanno un ruolo chiave nell attivazione in senso proinfiammatorio dei fibroblasti. Ambedue i tipi di nanoparticolato inducevano un aumento significativo del rilascio di ambedue le metalloproteasi dopo 24 h e in maniera dose-dipendente. L aumento di MMP3 risultava essere molto alto nelle cellule esposte a particelle Euro IV. La molecola MMP-3 è più potente dell MMP-9 come attivatore del rilascio di TNF-α, e pertanto dell attività pro-fibrotica, e influenza anche l attivazione delle cellule endoteliali e il richiamo di leucociti infiltranti che sono ritenuti uno dei fattori triggers più importanti per l induzione di fibrosi. Conclusioni I nostri risultati, che dimostrano la citotossicità e le alterazioni sia metaboliche che della membrana cellulare indotte dal particolato diesel (in maniera più marcata dall Euro IV che dall Euro III), la facile internalizzazione dello stesso sia nei compartimenti citoplasmatici cellulari che in sede intranucleare, il suo potenziale pro-ossidante e pro-infiammatorio e la sua capacità di attivare i fibroblasti ci sembrano molto incoraggianti per la verifica e la conferma dell ipotesi ambientale come una delle concause della Sclerosi Sistemica, come da noi prefigurato nel nostro progetto di ricerca. I risultati qui riportati sono stati oggetto di una pubblicazione originale su una rivista internazionale ad alto impatto scientifico (Carbon 2011, 4 9, ). Effects of carbonaceous nanoparticles from low-emission and older diesel engines on human skin cells Acknowledgments This study has been founded by GILS (Gruppo Italiano per la Lotta alla Sclerodermia).

5 Proseguimento della ricerca Sulla base di quanto osservato ci sembra molto interessante poter proseguire lo studio analizzando in maggiore dettaglio: 1) gli effetti di stimolo del nanoparticolato sull attività profibrotica dei fibroblasti umani provenienti da cute non lesionale di soggetti affetti da Sclerosi Sistemica, mediante lo studio di altri e più specifici markers di attivazione; 2) gli effetti sull induzione di attivazione e capacità pro-infiammatoria dei tipi cellulari che sono i precursori delle cellule endoteliali vascolari umane provenienti da sangue periferico di soggetti affetti da Sclerosi Sistemica. I risultati saranno confrontati con quelli ottenuti dopo stimolo con lo stesso nanoparticolato sui medesimi tipi cellulari provenienti da soggetti sani. Silvana Fiorito e Felice Salsano Roma, 10 Ottobre 2011