centrale (CNS) causata dall infezione litica degli oligodendrociti da parte del Polyomavirus JC (JCPyV). Ad

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1 RESOCONTO ATTIVITÀ DI RICERCA ANNO 2013 Studio dell espressione di fattori virali e cellulari implicati nella replicazione del Polyomavirus umano JC Responsabile scientifico: Dr. Simone Giannecchini, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica, Sezione di Medicina critica e medicine specialistiche, Viale Morgagni 48 PREMESSA La leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML) è una rara malattia demielinizzante del sistema nervosa centrale (CNS) causata dall infezione litica degli oligodendrociti da parte del Polyomavirus JC (JCPyV). Ad oggi, la PML è sempre più diagnosticata in casi di trapianto di cellule ematopoietiche o pazienti sottoposti a terapie biologiche innovative. Recentemente, è stato descritto che micrornas (mirna) prodotti da JCPyV down-regolano l espressione di geni virali precoci e interagiscono con fattori dell ospite aiutando il virus a persistere nell ospite evadendo le difese immunitarie. SCOPO Lo scopo dello studio è l analisi di fattori virali che possono regolare la riattivazione di JCPyV in pazienti immunosoppressi determinando un elevato rischio di sviluppo della PML. MATERIALI E METODI A- Selezione dei campioni per lo studio: Campioni di sangue (linfociti, plasma e siero) e urine da pazienti con infezione da HIV (collaborazione con Dott. Dario Bartolozzi, Malattie infettive, ospedale Universitario di Careggi, Firenze) pazienti con sclerosi multipla (SM) trattati o meno con natalizumab (collaborazione Prof. Massacesi, centro regionale di riferimento per la Sclerosi Multipla, ospedale universitario di Careggi, Firenze), pazienti HIV positivi con PML (collaborazione dott. Serena Delbue, Università di Milano) e donatori sani come controllo. Da ciascun campione sono stati estratti acidi nucleici, DNA ed RNA separatamente tramite kit commerciali specifici per l estrazione di DNA e microrna. 1

2 B- Ricerca del DNA di JCPyV e di altri Polyomavirus. PCR quantitativa real-time multiplex specifica per la sequenza del Large-T virale e per la regione NCCR utilizzata in laboratori di riferimento mondiali. In alcuni campioni selezionati è stato ricercato anche il DNA del Polyomavirus della scimmia SV40 allestendo una PCR qualitativa specifica per il Large-T dell SV40. C- Analisi dell espressione di microrna virali e cellulari. RT-PCR quantitative real-time stem-loop commerciali specifiche per i due microrna di JCPyV e l espressione di microrna cellulari. D- Esperimenti di infezione di substrati cellulari in vitro con JCPyV. In questi esperimenti in vitro sono state utilizzate cellule ematopoietiche CD34 + (KG-1), e le cellule di rene di scimmia COS-7, cellule altamente suscettibili all infezione con JCPyV per la presenza del Large-T antigene di SV40. Queste cellule sono state infettate con particelle di JCPyV ottenute con cloni molecolari. La replicazione virale è stata analizzata andando a ricercare il DNA di JCPyV a differenti tempi dell infezione tramite real-time PCR quantitativa specifica per il Large-T. Inoltre la produzione di particelle virali sarà valutata mediante saggi di emoagglutinazione compiuti con i lisati cellulari. L'espressione virale di microrna di JCPyV e quelli cellulari è stata valutata esattamente con le metodiche di RT-PCR quantitative descritte in precedenza. RISULTATI Ricerca di JCPyV nei campioni selezionati Nello studio sono stati esaminati i seguenti campioni: Pazienti HIV positivi (scelti anonimi e random): 80 campioni di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e plasmi (gruppo HIV); 14 campioni di siero di pazienti con PML (gruppo HIV/PML); 19 campioni di PBMC, plasmi e urine di pazienti MS sottoposti a terapie pre-natalizumab (gruppo MS); 39 campioni di PBMC, plasmi e urine di pazienti MS in terapia natalizumab (gruppo MS-NZ); 20 PBMC, plasmi e urine donatori sani (gruppo sani). L analisi molecolare di JCPyV ha evidenziato i seguenti risultati: 2

3 Gruppo HIV: 56/80 campioni positivi (70%) numero di copie di DNA virale (da 30 a 6x10 3 copie per microgrammo di DNA o ml, per PBMC o plasma e urine, rispettivamente); Gruppo HIV/PML: 14/14 campioni positivi (100%) numero di copie di DNA virale (da 10 3 a 3x10 4 copie per ml di siero); Gruppo MS: 6/19 campioni positivi (31%) numero di copie di DNA virale (da 10 2 a 10 3 oppure a 10 6 copie per microgrammo DNA o ml per PBMC o plasma e urine, rispettivamente); Gruppo MS-NZ: 23/39 campioni positivi (59%) numero di copie di DNA virale (da 2X10 2 a 10 3 oppure a 7X10 6 copie per microgrammo DNA o ml per PBMC o plasma e urine, rispettivamente). Gruppo sani: 4/20 campioni positivi (20%) numero di copie di DNA virale (da 10 2 a 10 3 oppure a 2X10 5 copie copie per microgrammo DNA o ml per PBMC o plasma e urine, rispettivamente). Nel complesso le prevalenze di JCPyV DNA ottenute rispecchiano quelle presenti in letteratura in simili campioni clinici. Tuttavia nello studio si evidenziata la presenza del DNA virale in un numero significativo di campioni di PBMC dei gruppi immunosoppressi (HIV, MS e MS-NZ) rispetto al gruppo di controllo (40/80, 17/39 e 4/19 verso 2/20). Inoltre, nei campioni HIV positivi tale valore è spesso contemporaneo alla presenza del DNA nel plasma. Ricerca di SV40 nei campioni HIV selezionati Nei campioni HIV positivi è stato ricercato anche il virus SV40 per osservare la sua presenza contemporanea a JCPyV. I risultati hanno evidenziato una prevalenza del 36% 29/80 campioni positivi). Espressione dei microrna 5p e 3p di JCPyV nei campioni selezionati L analisi dell espressione dei microrna di JCPyV nei PBMC positivi ha evidenziato i seguenti risultati: Gruppo HIV: 15/40 e 9/40 campioni positivi al 5p e 3p (37% e 22%) numero di copie di RNA virale (da 30 a 6x10 2 e da 20 a 10 2 copie per nanogrammo di RNA); 3

4 Gruppo MS: 2/4 e 2/4 campioni positivi al 5p e 3p (50% per entrambe) numero di copie di RNA virale (da 30 a 2x10 2 e da 20 a 60 copie per nanogrammo di RNA); Gruppo MS-NZ: 12/17 e 5/17 campioni positivi a 5p e 3p (70% e 29%) numero di copie di RNA virale (da 30 a 3x10 2 e da 20 a 80 copie per nanogrammo di RNA); Gruppo sani: 1/2 per entrambe i 5p e 3p (50%) numero di copie di RNA virale (da 20 a 50 copie per nanogrammo di RNA); All analisi di un microrna cellulare l espressione si è ottenuta al 80% in tutti i campioni dei suddetti gruppi. Tutti i campioni PBMC JCPyV DNA negativi sono risultati negativi ai due microrna. Successivamente l espressione dei due microrna di JCPyV è stata analizzata negli esosomi ottenuti nel plasma/siero e urine di tutti i campioni JCPyV DNA positivi e negativi ottenendo i seguenti risultati: Plasma/siero Gruppo HIV: 7/80 e 6/80 campioni positivi al 5p e 3p (8,7% e 7,5%) numero di copie di RNA virale (da 30 a 100 e da 20 a 60 copie per nanogrammo di RNA); Gruppo HIV/PML: 4/14 e 3/14 campioni positivi al 5p e 3p (28% e 21%) numero di copie di RNA virale (da 30 a 200 e da 20 a 60 copie per nanogrammo di RNA); Gruppo MS: 4/19 e 6/19 campioni positivi al 5p e 3p (21% e 31%) numero di copie di RNA virale (da 20 a 50 e da 20 a 60 copie per nanogrammo di RNA); Gruppo MS-NZ: 18/39 e 13/39 campioni positivi a 5p e 3p (46% e 33%) numero di copie di RNA virale (da 30 a 2x10 2 e da 20 a 90 copie per nanogrammo di RNA); Gruppo sani: 4/20 per entrambe i 5p e 3p (20% per entrambe) numero di copie di RNA virale (da 20 a 60 copie per nanogrammo di RNA); Urine (analisi solo per i campioni MS e MS-NZ e sani) 4

5 Gruppo MS: 5/19 e 6/19 campioni positivi al 5p e 3p (26% e 31%) numero di copie di RNA virale (da 20 a 2X10 2 e da 20 a 10 2 copie per nanogrammo di RNA); Gruppo MS-NZ: 15/39 e 15/39 campioni positivi a 5p e 3p (38% per entrambe) numero di copie di RNA virale (da 30 a 2x10 2 e da 20 a 90 copie per nanogrammo di RNA); Gruppo sani: 4/20 per entrambe i 5p e 3p (20% per entrambe) numero di copie di RNA virale (da 20 a 60 copie per nanogrammo di RNA); All analisi di un microrna ubiquitario i campioni HIV sono risultati spesso negativi mentre gli altri erano in generale positivi. L analisi dell espressione dei microrna presenti negli esosomi del plasma/siero e urina ha evidenziato che per i pazienti HIV la percentuale di positività è significamente ridotta rispetto agli altri gruppi. Sequenziamento regione microrna Sequenziando la regione che contiene i due microrna nel genoma di JCPyV dei campioni PBMC e urine positivi collettivamente è emerso che esistono differenti varianti contenenti 2-3 nucleotidi differenti che in certi campioni erano diverse nell urina e PBMC anche all interno dello stesso paziente. Esperimento di infezione in vitro Gli esperimenti in vitro hanno messo in evidenza che infettando cellule ampiamente suscettibili a JCPyV come le Cos-7 la replicazione virale è visibile con incremento del numero di copie di DNA già a partire dal terzo giorno post infezione e con la produzione di progenie virale rilevata con il saggio di emoagglutinazione dal nono giorno post-infezione. In questo sistema la produzione di microrna si osserva a partire da 24 ore postinfezione con incremento nel tempo sia nelle cellule che negli esosomi prodotti nei sopranatanti cellulari. Al contrario negli esperimenti utilizzando cellule KG-1 la replicazione virale è inefficiente ma la pesenza di microrna nelle cellule e negli esosomi contenuti nel sopranatante cellulare è ugualmente rilevabile. 5

6 CONCLUSIONI I risultati ottenuti mostrano che la presenza di JCPyV DNA nei PBMC è associata ad una espressione dei mirna di JCPyV che ne possono regolare la sua riattivazione mantenendo il virus persistente asintomaticamente nel sangue e/o in altri organi sede di latenza (rene o tessuti linfoidi). Inoltre emerge l evidenza che come i mirna cellulari anche quelli virali possono essere scambiati tramite gli esosomi da cellule a cellule come mezzi di regolazione a distanza. L importanza di tale evento è anche associata alla presenza di una variabilità genetica della regione genomica virale dei due mirna. Tuttavia, quando la prevalenza del JCPyV DNA aumenta ed è osservabile anche nel plasma come si evince nei campioni maggiormente immunocompromessi, come i pazienti HIV positivi, spesso l espressione dei mirna di JCPyV è ridotta. Sebbene i motivi di tale fenomeno vadano studiati (alterazione del meccanismo di produzione dei mirna o interferenza con altre molecole cellulari) tale fenomeno potrebbe essere fondamentale nelle prime fasi della riattivazione virale che precedono alo sviluppo della PML. Pubblicazioni Clausi V., Giannecchini S., Magnani E., Repice A., Mechi C., Martelli F., Azzi A., Massacesi L., Markers of JC Virus Infection in Multiple Sclerosis Patients Under Natalizumab Therapy. Multiple Sclerosis J. (sottomesso) Comunicazioni a congressi 1- Giannecchini S., Clausi V., Giovannelli I., Repice A., Massacesi L., Azzi A In vitro and ex vivo detection of human polyomavirus JC microrna. Polyomaviruses and Human Diseases: Basic and clinical Perspectives Grand Hotel Bristol - Stresa, Italy 9-11 Maggio 2013 (pubblicata sulla rivista J Neurovirol, 19:306). 6

7 2- Giannecchini S., Giovannelli I., Clausi V., Repice A., Massacesi L., Azzi A. Analisi dell espressione di microrna prodotti dal Polyomavirus JC. ATTI 41 congresso nazionale della Società Italiana di Microbiologia, Riccione, p.97, Ottobre