Dott. Elena Niccolai, PhD. Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica Università degli Studi di Firenze

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1 Dott. Elena Niccolai, PhD Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica Università degli Studi di Firenze Premio Gianfranco Del Prete per le malattie orfane, Firenze 8 novembre 2014

2 ADENOCARCINOMA PANCREATICO (AP) Quinta causa di morte per cancro nel mondo Tra i tumori dell apparato digerente, rappresenta la neoplasia più letale, con una sopravvivenza media di 4-6 mesi dalla diagnosi Solo il 20% dei pazienti con AP presenta una malattia potenzialmente suscettibile di resezione chirurgica alla diagnosi e la sopravvivenza globale, dopo 5 anni dalla chirurgia, non supera il 20%. le terapie oggi a disposizione per il trattamento del AP risultano scarsamente efficaci: fondamentale lo studio di nuovi approcci terapeutici mirati. IMMUNOTERAPIA SPECIFICA

3 Immunità e tumori IMMUNOTERAPIA SPECIFICA Rivelare antigeni tumorali Aumentare Qualità e Quantità di cellule immuni effettrici Eliminare i meccanismi immunosoppressivi del cancro

4 Linfociti T e Tumori Linfociti T CD8 + Linfociti T CD4 + Attività citolitica diretta: IFN-γ e TNF-α perforino-mediata Fas/Fas-L Attività helper Attività citotossica diretta (IFN-γ e TNF-α, perforino-mediata; Fas/Fas-L mediata)

5 Differenziazione linfociti T CD4 +

6 Antigeni associati a AP La selezione dell appropriato antigene tumore associato è essenziale per indurre risposte immunitarie forti e complete (sia umorali sia cellulari) in grado di arrestare la progressione del cancro nei pazienti Negli ultimi anni identificati molti antigeni associati al AP, (es. MUC1, Kras, la proteina coactosin-like ) ma, finora, il loro uso in terapia si è dimostrato inefficace recente scoperta dell α-enolasi (ENOA), antigene sovraespresso a livello del AP ed in grado di innescare risposte immuni nei pazienti (Cappello P et al. Int J Cancer 2009)

7 α-enolasi (ENOA): nuovo antigene tumore associato? Enzima glicolitico ubiquitario multifunzionale. Si trova sovraespresso sulla superficie di molte cellule cancerose, fra cui quelle pancreatiche (Cappello et al. Int J Cancer 2009) Sulla membrana cellulare agisce da recettore per il plasminogeno, meccanismo che lo vede coinvolto nella migrazione delle cellule neoplastiche (Cappello et al. FEBS J 2011) È in grado di suscitare risposte immuni sia umorali che cellulomediate; la presenza di autoanticorpi anti-enoa si associa ad una prognosi migliore (Tomaino et al. J Proteome Res 2011) In modelli murini di cancro pancreatico, la vaccinazione con ENOA si è dimostrata capace di ritardare la progressione tumorale e di allungare il tempo di sopravvivenza dei topi (Cappello et al. Gastroenterology 2013)

8 Scopo dello studio Valutare se ENOA è in grado di innescare una risposta T specifica in pazienti con AP Studiare le caratteristiche (protettive o protumorali) delle cellule immunitarie T ENOAspecifiche infiltranti il tumore

9 15 pazienti affetti da adenocarcinoma pancreatico duttale (età media 63 anni) Prelevati frammenti di mucosa pancreatica provenienti dalla regione centrale del tumore (CT), dalla regione a margine del tumore (MT) e dalla circostante mucosa sana (HS) TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) Clonazione ad alta efficienza 10 giorni 15 giorni IL-2 50U/ml Cloni T

10 Caratteristiche dei pazienti e progenie clonale ottenuta Paziente Età Sesso TNM Cloni linfocitari T ottenuti PP 50 M pt3, N1, Mx 84 MR 73 M pt4, N1, Mx 26 PR 56 M pt3, N0, Mx 6 PT 36 M pt2, N1, M1 16 NN 74 F pt3, N1, Mx 91 ME 61 F pt2, N1, Mx 20 DA 63 M pt3, N1, Mx 37 RA 74 F pt3, N0, Mx 74 MM 54 F pt3, N0, Mx 5 PL 92 M pt3, N1, Mx 3 CM 57 M pt2, N1, M1 22 RA 51 F pt4, N1, Mx 13 BB 72 F pt3, N1, Mx 22 BR 80 F pt2, N1, M1 58 RP 58 M pt3, N0, Mx 28 Tutti i pazienti 63 8M/7F Adenocarcinoma duttale pancreatico 505

11 Presenza di linfociti T ENOA-specifici in pazienti con AP (3%) 87 (97%) T ENOAspecifici CD4+ T ENOAspecifici CD (18%) (9%) 20 (15%) 221 Tutti i siti MS MT CT 56 (25%) Cloni T ottenuti Cloni T ENOA-specifici

12 Caratterizzazione funzionale dei linfociti T ENOA-specifici in pazienti con AP Cloni T CD8 + ENOA-specifici (Tutti i Siti) 60 53% Cloni T CD4 + ENOA-specifci (Tutti i Siti) Tc Null (CT) Tc0/Tc17 (MS) % 9% 14% 6% 5% 4% 0 Tc0 (CT) 67% IFN-γ 71% IFN-γ

13 Distribuzione delle popolazioni di linfociti T CD4 + ENOA-specifici nei tre diversi siti del tumore pancreatico Circa il 73% di tutti i cloni Th17 erano in grado di produrre anche IFN-γ (Th1/Th17)

14 % Rilascio 51 Cr % Rilascio 51 Cr Valutazione dell attività citotossica perforino-mediata dei cloni T ENOAspecifici MS CT Tutti i cloni T helper producenti IFN-γ (tranne 4 Th0) lisavano la cellula bersaglio. Nessuno dei Th2, dei Tnull o dei Treg era capace di lisare le cellule B-EBV. 2 dei 3 cloni T ENOA-specifici CD8 + distruggevano le cellule bersaglio, mentre il clone Tc null non ne era capace. Il rilascio specifico di 51 Cr è molto più elevato da parte dei cloni Th17 e Th1 isolati da MS piuttosto che da quelli isolati da CT.

15 Valutazione dell attività citotossica Fas-FasL mediata dei cloni T ENOA-specifici 45 degli 87 cloni CD4 + (51%) e 1 (Tc0) (33%) dei 3 cloni CD8 + erano in grado di indurre apoptosi nelle cellule bersaglio. Tra i 45 cloni T CD4 + capaci di indurre apoptosi nelle cellule Panc1, 37 erano Th1, 6 Th17, 2 Th0, ma nessuno era Th2, Treg o Tnull.

16 Cellule Treg ENOA-specifiche inibiscono la proliferazione delle cellule T effettrici Il 75% (9/12) dei cloni Treg ENOA-specifici erano in grado di inibire la proliferazione di cloni T effettori ENOA-specifici

17 Rapporto Treg/Teffetrici ENOA-specifiche I pazienti con un rapporto di cellule Treg/T effettrici ENOA-specifiche basso tendono a sopravvivere più a lungo (più di 10 mesi), rispetto a quelli con un rapporto Treg/T effettrici più alto (meno di 10 mesi)

18 Conclusioni (1) presenza di cellule T ENOA-specifiche a livello tumorale in pazienti con adenocarcinoma pancreatico (~20%) Maggior parte producenti IFN-g Cellule T intratumorali ENOA-specifiche con profilo Treg Effetto immunomodulante del microambiente tumorale

19 Conclusioni (2) Certi approcci terapeutici (vaccinazione con ENOA) potrebbero rappresentare una nuova ed efficace via per il trattamento di pazienti affetti da AP se impiegati in combinazione a strategie volte a contrastare gli effetti delle Treg e a migliorare le funzioni effettrici delle Th1/Th17.

20 Obiettivi futuri caratterizzare la funzionalità delle cellule T ENOA specifiche presenti nel sangue periferico dei pazienti con AP confronto lo studio dei differenti epitopi antigenici dell ENOA valutare l effetto immunoregolatorio del microambiente del tumore del pancreas

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