NEUROENDOCRINI GENERICI

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1 L indagine immunoistochimica richiesta prevede l utilizzo di marcatori neuroendocrini generici NEUROENDOCRINI GENERICI Enolasi Neurono-Specifica (NSE) Sinaptofisina (SYN) Cromogranina generalmente di tipo A (CgA)

2 Il marcatore citosolico universalmente utilizzato è costituito dalla NSE: Enolasi Neurono-specifica: E un isomero neurospecifico di un enzima glicolitico (enolase) ubiquitario, non associato a vescicole bensì presente in quantità significative nel citoplasma cellulare. E una molecola distribuita in tutte o quasi tutte le cellule neuroendocrine, normali o tumorali L espressione di markers citosolici è identificabile anche in neoplasie scarsamente differenziate e agranulari.

3 Molecole associate a strutture sub cellulari citoplasmatiche (granuli di secrezione e vescicole sinaptiche) sono invece rappresentate da SINAPTOFISINA : La sinaptofisina è una glicoproteina legante il calcio (38,000 Kd), presente come costituente della membrana delle vescicole sinaptiche dei neuroni. E presente anche in un ampio spettro di cellule neuroendocrine e in molti dei tumori che da esse derivano. Il pattern IHC è tipicamente granulare nelle regioni sinaptiche dei neuroni, mentre ha aspetto sia citoplasmatico diffuso che granulare nelle cellule neuroendocrine

4 CROMOGRANINA A (CgA) E una glicoproteina acida, ad elevato peso molecolare. E contenuta insieme ad altri ormoni peptidici nei granuli secretori dei tessuti neuronali e neuroendocrini. Rappresenta il precursore di molti altri peptidi a più basso peso molecolare e sembra essere coinvolta nei meccanismi di adesione e proliferazione delle cellule neuroendocrine sia normali che neoplastiche. La sua espressione varia a seconda del grado di differenziazione cellulare ed è caratterizzata da un aspetto morfologico più granulare e meno diffuso

5 Caso Corpo e coda del pancreas di complessivi cm 10 di lunghezza... al taglio in regione corpale... e' presente area nodulare emorragica multicistica di cm 2,5 di asse maggiore COSA CI HA CHIESTO IL PATOLOGO?? NSE + SYN + CROMO A QUALI PROBLEMI PER BUONA IHC??

6 QUALCOSINA NON CROMO 1:700 SYN 1:100 FUNZIONA?!?!

7 CdQ Standardizzazione IHC Flow Chart 1a Fase TMA controllo Normale TMA controllo Neoplastico TMA controllo Neoplastico TdF Casi Routine 2a Fase 3a Fase

8 Tessuti Normali

9 SCALARE DILUIZIONI ANTI-SINAPTOFISINA CLONE SY38 Dil 1:100 1:200 1:300 SYN 1:100 SYN 1:300 SYN 1:100 SYN 1:300

10 UTILIZZO DI TESSUTO NEOPLASTICO TMA NEUR-B Controllo Syn/CrgA/NSE 1,3) solo neoplasia 2) neoplasia + pancreas ANTI-SINAPTOFISINA Dil 1:100 1:200 1:300

11 SYN 1:200 1: 2 50?? SYN 1:100 TMA NEUR B SYN 1:300 Verifica per diluizione ottimale

12 SENSIBILITA AI TEMPI DI FISSAZIONE ANTI-SINAPTOFISINA Dil 1:100 1:200 1:300 TMA NEUR-A Controllo T-fix stessa neoplasia fissata per 1) 6 ore 2) 1 gg 3) 6 gg 2 1 3

13 SYN 1:200 1: 2 50?? SYN 1:100 Verifica per diluizione ottimale TMA NEUR A SYN 1:300

14 Verifica per tempo di fissazione su diluizione ottimale TMA NEUR A 2 1 gg SYN 1: ore 3 6 gg

15 CROMOGRANINA A VALUTAZIONE DELLA IHC SULLA COMPONENTE SIA NORMALE CHE NEOPLASTICA ANTI-CROMOGRANINA A Dil 1:700 1:900 1:1100 1:1400 TMA NEUR B

16 CROMO 700 CROMO 900 CROMO 1100 CROMO 1400

17 CROMO 700 CROMO 900 CROMO 1100 CROMO 1400

18 IHC RICHIESTA SUI DUE CASI ROUTINE

19 Caso pancreas... al taglio... e' presente area nodulare emorragica multicistica di cm 2,5 di asse maggiore CRG A SYN NSE

20 Caso ILEO.. Segmento intestinale... mostrante a cm 6 da entrambi i margini di resezione neoformazione giallastra... SYN CRG A

21 FATTORI PROGNOSTICI NON MORFOLOGICI: QUOTA PROLIFERANTE DETERMINATA MEDIANTE Ki-67 Proliferazione come fattore prognostico indipendente Per TNE pancreas e stomaco European Neuroendocrine Tumor Society (ENETS) Grading for Gut TNE G1 < 2% G2 > 2% <20% G3 > 20% Non concordanza sui cut-off in vari distretti

22 ESTREMA VARIABILITA PER Ki-67 Ki-67 = 57% STOMACO Carcinoma neuroendocrino scarsamente differenziato (G3) SEMBRA SEMPRE DI PIU

23 ESTREMA VARIABILITA PER Ki-67 Ki-67 = 1,3% ILEO: Carcinoma neuroendocrino ben differenziato, (G1) Ki-67 = 0,3%

24 VALUTAZIONE QUANTITATIVA MEDIANTE SOFTWARE DEDICATI

25 Selezione nuclei totali Conteggio area

26 Selezione nuclei positivi Conteggio area positivi

27 IL PASSAGGIO PIU CRITICO NELLA VALUTAZIONE QUANTITATIVA CON SOFTWARE DEDICATI NON E LA PROCESSAZIONE DELL IMMAGINE MA LA SELEZIONE DEI CAMPI DA VALUTARE RANDOMIZZAZIONE

28 Solo cellule all incrocio selezione aree: 30 aree = 2 aree

29 IHC RICHIESTA SUI DUE CASI ROUTINE

30 Caso Ileo Ki-67 = 1,0% Caso Pancreas Ki-67 = 0,6%

31 IHC RICHIESTA SUL CASO ILEO ROUTINE

32 Caso Ileo ANTI-SEROTONINA Lesione Ileo Metastasi Epatica

33 MA VALE LA PENA FARE TUTTO QUESTO LAVORO?? IN FONDO IL PATOLOGO PUO LEGGERE UN VETRO DI IHC ANCHE SE NON PROPRIO OTTIMALE!?!?

34 Caso PANCREAS Riscontro occasionale quindi intera batteria per pancreas: - INSULINA - GASTRINA - GLUCAGONE - VIP - SOMATOSTATINA - SEROTONINA - PP - (PGR)

35 Gastrina Gastrina Glucagone Glucagone FALSO POSITIVO. su pancreas per Glucagone controllo insule, ma es. non con gastrina

36 Glucagone Glucagone Glucagone Glucagone Evitare al patologo la possibilità del FALSO POSITIVO

37 NEGATIVI TUTTI I PEPTIDI TRANNE PP (Polipeptide Pancreatico) + PGR per conferma vero primitivo pancreas PP PGR

38 RECETTORI PER LA SOMATOSTATINA PRESENTE NEI TESSUTI NORMALI E NEOPLASTICI EFFETTO ANTIPROLIFERATIVO SE ATTIVATI 5 TIPI MOLECOLARI = SSTR-1, 2, 3,4,5 sottotipi 2A-2B SSTR2A FORMA PIU ESPRESSA NEI TNE-GEP ELEVATA AFFINITA PER LA SOMATOSTATINA E PER ANALOGHI SINTETICI (OCTEOTRIDE) UTILIZZATI A SCOPO DIAGNOSTICO-TERAPEUTICO

39 RECETTORI PER LA SOMATOSTATINA DETERMINAZIONE MEDIANTE TECNICHE MOLECOLARI DETERMINAZIONE IHC POSSIBILE, MA CON ANTICORPI DI RICERCA NON FUNZIONANTI SU MATERIALE FISSATOINCLUSO RECENTE PRODUZIONE DI ANTICORPI ANTI-SSTR PER ROUTINE (SSTR2A)

40 CdQ Standardizzazione IHC SSTR2A TMA controllo Normale/Neoplastico TMA controllo Neoplastico TdF CASISTICA NON SELEZIONATA CRITERI DI VALUTAZIONE Casi Routine

41 COSTRUZIONE TISSUE MACROARRAY Conoscenze dalla letteratura + caso positivo

42 Tab. 1: confronto dei risultati ottenuti con tampone citrato ph 6,0 e tampone Tris-EDTA ph 9,0 per anti-sstr2a Ab anti-sstr2a Diluizioni Tipo AR 1:1000 1:2000 1:3000 1:4000 1:5000 1:6000 1: :8000 1: :1200 1: S Citrato ph 6, /3 2/3 2/3 3 3 F 3 3 2/3 2/ /0 0 I 1 1 1/2 1/2 2 2/3 2/3 2/3 3 3 S 2/3 2/3 2/3 F I Tris-EDTA ph 9,0 Tipo AR Citrato ph 6,0 Tris-EDTA ph 9,0 Ab anti-sstr2a Diluizioni 1: :18000 S 3 3 F 0 0 I 2 1/2 S 3 3 F 1/0 1/0 I 3 2/3 LEGENDA: S=Specificità (0-3); F=Fondo (0-3); I=Intensità (0-3)

43 ETEROGENEITA DI ESPRESSIONE ALL INTERNO DELLA STESSA NEOPLASIA

44 VALUTAZIONE SEMIQUANTITATIVA POSITIVITA DI MEMBRANA CON QUICK SCORE Percentuale <1% = Score 0; 1<25% = Score 1; 25<50% = Score 2; 50<75% = Score 3; 75% = Score 4 Intensità Negativa = score 0; debole = score 1; moderata = score 2; forte = score 3 POSITIVITA CITOPLASMATICA (SOLO SE 10%)

45 Score 0 Score 1 Score 2 Score 3

46 IHC RICHIESTA SUI DUE CASI ROUTINE

47 Caso Pancreas Caso Ileo

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