Microbiologia Dipartimento di Farmacia e BioTecnologie Università di Bologna

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1 Microbiologia Dipartimento di Farmacia e BioTecnologie Università di Bologna Prof. Giorgio Gallinella Prof.ssa Giovanna Gentilomi Dott.ssa Francesca Bonvicini (ricercatore) Dott.ssa Elisabetta Manaresi (ricercatore) Dott.ssa Gloria Bua (dottoranda) Policlinico universitario S.Orsola Microbiologia (Padiglione 11)

2 PARVOVIRUS B19 Classificazione ICTV Famiglia: Parvoviridae Sottofamiglia: Parvovirinae Genere: Erythrovirus Specie: B19 (Genotipi 1-3) GENOMA DNA a singolo filamento a polarità +/- costituito da 5596 nucleotidi Capside icosaedrico (22 nm), composto da due proteine strutturali (VP2 e VP1) NS VP1u VP2

3 Parvovirus B19: tropismo Cellule progenitrici eritroidi nel midollo osseo CD36+ (proeritroblasti) Linee cellulari erythroid-like: UT7/Epo S1

4 Parvovirus B19: manifestazioni cliniche Trasmissione: via respiratoria Eritema infettivo o Quinta malattia Sindromi poliartropatiche Crisi aplastiche transitorie Ipoplasia eritrocitaria Idrope fetale

5 PROGETTI DI RICERCA A. Studio dell interazione virus-cellula e della regolazione dell espressione virale; ricerca di potenziali molecole con attività antivirale B. Sviluppo di un sistema per la produzione di virus ricombinanti

6 A. Studio dell interazione virus-cellula e della regolazione dell espressione virale 1. Isolamento di PBMC da sangue periferico mediante Ficoll 2. Coltura dei PBMC in terreno adatto a promuoverne il differenziamento in senso eritroide Isolamento PBMC da sangue periferico 3. Caratterizzazione dello stato di differenziamento tramite citofluorimetria a flusso 4. Infezione di PBMC a diversi stadi di differenziamento con Parvovirus B19 Caratterizzazione di una popolazione cellulare in citofluorimetria

7 A. Studio dell interazione virus-cellula e della regolazione dell espressione virale 5. Studio della replicazione ed espressione virale: a. ricerca di acidi nucleici virali (Real Time PCR, FISH) Real Time PCR b. analisi dell espressione di proteine virali (immunoflurescenza indiretta, citofluorimetria) Flow-FISH (Fluorescence in situ hybridization combined with flow cytometry)

8 A. Ricerca di potenziali molecole con attività antivirale progettazione de novo utilizzando metodi computazionali screening di molecole antivirali già note (CIDOFOVIR) Target specifici per farmaci antivirali 1. Proteina NS : attività replicativa, citotossica, pro-infiammatoria 2. Regione VP1u: fosfolipasi virali, pro-infiammatoria Antivirali ad ampio spettro: Cidofovir (CDV) 1. Nucleotide aciclico fosfonato, analogo della citosina (dcmp) CDV dcmp

9 A. Ricerca di potenziali molecole con attività antivirale 1. Infezione di cellule UT7/EpoS1 e EPCs con Parvovirus B19 in presenza di diverse concentrazioni del composto antivirale da testare 2. Analisi dell effetto del composto sulla replicazione ed espressione di Parvovirus B19: Quantificazione degli acidi nucleici virali (Real Time PCR) Espressione di proteine virali (Immunofluorescenza indiretta) Saggio con BrdU Saggi di vitalità e proliferazione cellulare (saggio con BrdU e saggio AlamarBlue ) Saggio AlamarBlue

10 B. Sviluppo di un sistema per la produzione di virus ricombinanti 1. Clonazione in vettore plasmidico del genoma di Parvovirus B19 e trasformazione di cellule batteriche 2. Purificazione del DNA plasmidico ricombinante 4. Trasfezione di EPCs 5. Recupero del surnatante e successiva infezione di EPCs permissive per valutare la presenza e attività di virus infettante mediante: a. Ricerca di acidi nucleici virali nelle cellule infettate (Real Time PCR, FISH) Clonazione molecolare Trasformazione di cellule batteriche b. Analisi dell espressione di proteine virali (immunoflurescenza indiretta) Trasfezione di cellule eucariotiche

11 Real Time PCR ricerca e quantificazione degli acidi nucleici virali Saggi di immunofluorescenza indiretta espressione di proteine virali

12 Tecniche in uso in laboratorio: Tecniche microbiologiche di base Tecniche di coltura in vitro di cellule eucariotiche e saggi di vitalità e proliferazione cellulare (saggio con BrdU e saggio AlamarBlue ) Tecniche di biologia molecolare: clonaggio in vettori plasmidici, trasformazione di batteri competenti e purificazione di DNA plasmidico; trasfezione di cellule eucariotiche; saggi di immunofluorescenza su vetrino e con analisi al citofluorimetro; preparazione di sonde a DNA e RNA marcate con digossigenina; saggi di ibridazione molecolare in situ; purificazione di acidi nucleici con estrattori automatici; uso della PCR (PCR end point e PCR real time).

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