Trasferimento genico in cellule animali

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1 Trasferimento genico in cellule animali In 3 modi: 1. Trasferimento diretto del DNA in cellule bersaglio mediante mezzi fisici. Es. microiniezione in vitro o in vivo, bombardamento con microproiettili rivestiti di DNA. 2. Trasfezione: metodi sia chimici che fisici con i quali il DNA viene internalizzato dal terreno di coltura (in vitro) o dall ambiente extracellulare (in vivo) 3. Trasduzione: impaccamento del DNA all interno di virus animali A prescindere dalla metodica, la trasformazione può essere stabile o transiente a seconda di quanto il DNA esogeno rimane all interno della cellula bersaglio

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3 Coprecipitazione di DNA con calcio fosfato (I, 1962, Szybalska e Szybalsky) Formazione di un sottile coprecipitato di DNA e calcio fosfato che si deposita sulle cellule e poi viene internalizzato. I piccoli granuli di calcio associati a DNA entrano nella cellula per endocitosi e sono trasportati fino al nucleo dove alcune molecole di DNA si dissociano dal precipitato e possono venire espresse. Cellule che non possono essere trasfettate col metodo del calcio: con DEAE (dietilamino-etil destrano), carboidrato policationico, idrosolubile, favorisce interazione tra DNA esogeno ed il macchinario endocitotico della cellula

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5 Cotrasformazione e selezione dei trasformanti stabili Una volta diventato di uso comune il metodo del calcio fosfato, è stato dimostrato che cellule di topo carenti dell enzima tirosina chinasi(tk) potevano essere trasformate nel fenotipo selvatico mediante trasfezione con il gene TK del virus Herpes simplex. Come nel caso di trasformanti HPRT+, le cellule positive per TK possono essere selezionate in terreno HAT: entrambi gli enzimi sono coinvolti nella biosintesi dei nucleotidi attraverso la via metabolica di recupero

6 Sintesi de novo e di recupero dei nucleotidi nei mammiferi De novo: la sintesi parte da precursori di base, zuccheri e aminoacidi. Se questa è bloccata, la produzione di nucleotidi dipende dalla via di recupero e ciò consente la selezione di quelle cellule che acquisiscono copie funzionali dei geni Hprt e Tk in seguito a trasfezione. Di recupero: vengono riciclati nucleotidi derivati da DNA e RNA.

7 Il farmaco aminopterina blocca la sintesi de novo sia dell inosina monofosfato (IMP) che della timidina monofosfato (TMP) inibendo enzimi chiave nella via metabolica Cellule esposte alla aminopterina possono sopravvivere solo se contengono copie funzionali dei geni Hprt e Tk ed hanno a disposizione una fonte di ipoxantina e timidina. I trasformanti Hprt+ e Tk+ possono essere selezionati utilizzando il terreno HAT che contiene ipoxantina, aminopterina e timidina

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9 Ma.. Quanto sopra detto, si riferisce agli esperimenti nei quali il transgene di interesse (Tk e Hprt) conferiva alle cellule un fenotipo selezionabile. La maggior parte dei geni non ha questa caratteristica, quindi l isolamento dei trasformanti rimane di difficile attuazione. Scoperta risolutiva: cotrasformazione

10 COTRASFORMAZIONE Possibilità di trasfettare le cellule contemporaneamente con due DNA indipendenti ed ottenere l integrazione di entrambi i transgeni sul genoma. Cotrasformanti ottenuti con: gene Tk di HSV ed un eccesso di pbr322. Le cellule selezionate in terreno HAT sono state analizzate mediante southern blot per controllare la presenza del plasmide non oggetto di alcuna selezione. Il DNA non selezionato era presente in quasi il 90% delle cellule TK+, dimostrando che il gene Tk poteva essere utilizzato come marcatore selezionabile anche per DNA trasfettanti non altrimenti selezionabili

11 I vettori di espressione per cellule di mammifero psv2-dhfr e prsv-neo

12 Vettori plasmidici per il trasferimento genico mediato da DNA L impiego dei plasmidi nelle trasfezioni può portare molti vantaggi che dipendono dagli elementi modulari contenuti nei vettori stessi. I plasmidi psv e prsv sono un esempio dei primi vettori di espressione utilizzabili in cellule animali. Le sequenze dei virus SV40 e sarcoma di Rous hanno funzione di controllo trascrizionale in molti tipi cellulari, quindi la loro incorporazione in pbr322 ha generato vettori di espressione grazie ai quali è virtualmente possibile controllare la trascrizione di qualsiasi transgene una volta integrato nel genoma delle cellule trasfettate

13 Trasformazione con vettori contenenti repliconi Repliconi derivati da polioma virus: è possibile ottenere una trasformazione transiente anche utilizzando dei repliconi che contengono l origine di replicazione di virus tipo SV40.

14 SV40 possiede un piccolo capside ed un DNA circolare a doppio filamento di circa 5kb. Il genoma è organizzato in due distinte unità trascrizionali, dette precoce e tardiva, orientate in direzioni opposte. I trascritti vanno incontro a splicing alternativo e producono un gruppo di proteine diverse. La regione precoce codifica per delle proteine di regolazione mentre la regione tardiva produce i componenti strutturali del capside

15 Significativo passo avanti Plasmidi contenenti l origine di replicazione virale erano in grado di comportarsi come il virus stesso cioè si replicavano ad alto numero di copie in cellule permissive di scimmia; ma tali repliconi di SV40 non erano impaccati nel capside virale e quindi venivano meno le limitazioni steriche imposte da quest ultimo

16 Sono stati sviluppati vettori di clonaggio a partire da plasmidi di E.coli, inserendo al loro interno piccoli frammenti del genoma di SV40 che comprendevano l origine di replicazione. Es.: il vettore di espressione transiente pcdna3.1 ha le origini di SV40 e di polioma, un sito di clonaggio multiplo e il marcatore per la resistenza all ampicillina

17 Trasferimento genico mediante trasduzione virale Il Dna esogeno da clonare può essere incorporato nel genoma virale o aggiungendolo all interno del genoma virale o mediante sostituzione di uno o più geni endogeni. Se il transgene viene aggiunto al genoma o sosituisce geni non essenziali per il ciclo infettivo nell ospite, si parla di vettori competenti per la replicazione o indipendenti dall helper perché sanno replicarsi da soli. Se il transgene rimpiazza un gene virale essenziale, il vettore viene detto difettivo per la replicazione o dipendente dall helper. Le cellule allora vanno trasfettate con un plasmide helper, contenente il gene mancante

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20 Adenovirus: virus a DNA con molecola lineare a doppio filamento lunga circa 36kb. Nella mappa: posizioni delle unità di trascrizione precoci (E), del principale trascritto tardivo (MLT), della sequenza leader tripartita (TL) e di altri geni (VA, plx, IVa2). Le sequenze terminali ripetute sono in viola. Psi indica il sito di impaccamento. Gli adenovirus possono contenere grandi quantità di DNA esogeno, possono infettare molti tipi cellulari diversi. Non si integrano efficientemente nel genoma della cellula ospite per cui sono adatti per l espressione transiente in cellule proliferanti

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22 BACULOVIRUS:genoma di grandi dimensioni di DNA a doppio filamento in un capside a bastoncello, infettano le cellule di artropodi, insetti La costruzione di vettori di espressione di baculovirus richiede l inserzione del transgene a valle del promotore della poliedrina ma poiché il genoma virale è di grandi dimensioni e non si presta al taglio con enzimi di restrizione, tale sostituzione è ottenuta mediante ricombinazione omologa grazie a un plasmide che contiene una regione derivata dal baculovirus

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24 Vettori basati su herpesvirus Degli herpesvirus, virus a doppio filamento di DNA con capside icosaedrico e presenza d'un involucro lipidico, viene utilizzato il virus Herpes simplex di tipo 1 (HSV-1). Si tratta d'un virus neurotropo in grado d'instaurare un ciclo litico ma anche di persistere sotto forma episomiale nella cellula ospite. Il genoma di HSV-1 è formato da un doppio filamento di DNA di 152 kb che contiene almeno 80 geni. Non appena inizia il ciclo litico viene espressa la proteina VmW65 che attiva i geni precoci immediati (IP0, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47) che fungono da fattori transattivanti per gli altri geni precoci che codificano prodotti necessari per la replicazione ed il metabolismo dei nucleotidi. Successivamente vengono attivati I geni tardivi codificanti per proteine strutturali. Il ciclo si conclude con la lisi della cellula.

25 Per ottenere un HSV-1 vettore sono stati usati due approcci. Il primo consiste nell'uso d'unamplicone, un plasmide contenente un'origine di replicazione batterica (generalmente da E. coli), una di HSV-1 (OriS), la sequenza di packaging di HSV-1 ed il gene da inserire. Il tutto viene inserito in una linea cellulare infettata da un virus helper contenente i geni regolatori e strutturali mancanti. Il secondo approccio consiste nell'uso d'un virus ricombinante ottenuto eliminando uno o più geni precoci immediati e facendo produrre le particelle da cellule esprimenti le proteine mancanti. Questo approccio è gravato dal fatto che il vettore così prodotto risulta essere neurotossico.

26 Vettori retrovirali Vettori Retrovirali e Lentivirali I vettori retrovirali derivano principalmente dall oncoretrovirus MoLV ( Moloney Leukemia Virus ). Questi vettori sono stati tra i primi ad essere sviluppati, grazie alla relativa semplicità di costruzione, alla loro capacità di trasdurre un ampia varietà di tipi cellulari integrandosi all interno del genoma e alla loro non patogenicità per l uomo. Questi vettori sono in grado di accogliere fino a circa 7Kb di DNA esogeno contenente il transgene. Nonostante questi vantaggi, la divisione cellulare è un requisito indispensabile per permettere a questi vettori di trasdurre la cellula e di integrare il genoma e questo limita il loro utilizzo a bersagli cellulari che naturalmente o artificialmente siano in attiva proliferazione. Per ovviare a questo problema, si è pensato di costruire vettori derivati dalentivirus, comehiv. A differenza deglioncoretrovirus, per i quali la divisione cellulare rappresenta un requisito indispensabile per l integrazione nella cromatina della cellula infettata, i lentivirus hanno sviluppato l abilità di integrarsi anche nella cromatina di cellule non proliferanti, grazie alla capacità del provirus di attraversare la membrana nucleare.

27 Tramite tre generazioni di progressive modifiche e miglioramenti si è giunti ad un vettore lentivirale costituito da meno del 10% del genoma virale iniziale in cui sono presenti solo le sequenze necessarie a retrotrascrivere, trasferire ed integrare la cassetta di espressione nelle cellule bersaglio e sono assenti i geni per le proteine virali patogene. La costruzione di questi vettori ha raggiunto buoni livelli di biosicurezza, grazie anche all inattivazione del promotore virale originale presente nelle LTR. I vettori lentivirali hanno dimostrato una buona efficienza di trasduzione sia in vitro sia in vivo, affiancando alle qualità dei vettori basati su oncoretrovirus la capacità di trasdurre cellule non in attiva proliferazione, come ad esempio gli epatociti (cellule del fegato), le cellule muscolari e le cellule staminali emopoietiche. Uno svantaggio dei vettori derivati da virus integranti come MoLV o HIV è rappresentato dal fatto che l integrazione nel genoma avviene in modo non controllato e questo può comportare fenomeni di mutagenesi inserzionale. Può infatti accadere che il vettore si inserisca all interno di un gene cellulare essenziale, determinandone la perdita di funzione e provocando la morte della singola cellula. Può anche accadere che il vettore si inserisca all interno di genioncosoppressori, inattivandoli, oppure in prossimità di protooncogeni, alterandone i profili di espressione e potenzialmente attivandoli quando non dovrebbero esserlo. In uno di questi ultimi due casi, la cellula contenente quella specifica integrazione potrebbe acquisire un vantaggio proliferativo sulle altre e dare origine a una popolazione cellulare espansa più prona alla trasformazione tumorale. I

28 Mappa genomica di un oncoretrovirus generico. La parte superiore mostra la struttura del provirus integrato nel quale le lunghe sequenze ripetute terminali (LTR) comprendono al loro interno le regioni U3,R e U5. Le due LTR delimitano tre ORF, denominate gag, pol e env. In basso: RNA genomico impaccato che manca delle strutture delle LTR e possiede una coda di poli_a

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30 Sindbis virus e Semliki forest virus (alfavirus) Famiglia di enveloped virus, avvolti cioè da una membrana fosfolipidica derivata dalla cellula infettata che li ha prodotti il cui genoma è formato da una molecola di RNA a singolo filamento. La loro replicazione è confinata nel citoplasma, il loro genoma non si può integrare in quello della cellula ospite. A partire dal genoma di alfavirus sono stati sviluppati sia repliconi plasmidici che vettori virali di trasduzione

31 Il vettore psinrep5 prodotto dalla Invitrogen, basato sil virus Sindbis

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33 Virus del vaiolo vaccino come vettore Poxvirus: struttura complessa e genoma lineare a doppio filamento lungo fino a 300 kb. Strano per virus a DNA: la replicazione avviene nel citoplasma piuttosto che nel nucleo. I costrutti ricombinanti vengono generati per ricombinazione omologa, fornendo un plasmide contenente il VGP fiancheggiato da sequenze virali a cellule già infettate dal virus.