ALLERGENI: Metodi & Analisi

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1 ALLERGENI: Metodi & Analisi 1

2 PARLEREMO DI Allergeni (definizioni e classificazioni) Normativa e limiti di legge R&C Lab e gli allergeni Metodi e tecniche analitiche applicate 2

3 Allergeni (definizioni e classificazioni) Un allergia alimentareèuna patologia legata a reazioni del sistema immunitario nei confronti di particolari proteine, dette allergeni, considerate estranee dall organismo. Buongiorno sono l allergene Lattosio Le intolleranze alimentari, pur potendo provocare sintomi simili a quelli delle allergie, non coinvolgono il sistema immunitario e sono generalmente provocate dalla difficoltàdi digerire un alimento (per esempio a causa di deficit di determinati enzimi digestivi). 3

4 Schema della classificazione della EAACI delle reazioni avverse agli alimenti: IPERSENSIBILITA ALIMENTARE IPERSENSIBILITA ALIMENTARE NON ALLERGICA ALLERGIA ALIMENTARE Allergia alimentare IgE-mediata Allergia alimentare non IgE-mediata 4

5 All. II (Reg. (UE)1169/2011 SOSTANZE O PRODOTTI CHE PROVOCANO ALLERGIE O INTOLLERANZE 1. Cereali contenenti glutine (grano, segale, orzo, ) 1. Crostacei e prodotti a base di crostacei 2. Uova e prodotti a base di uova 3. Pesce e prodotti a base di pesce 4. Arachidi e prodotti a base di arachidi 5. Soia e prodotti a base di soia 6. Latte e prodotti a base di latte (incl. Lattosio) 7. Frutta a guscio, vale a dire: mandorle, nocciole, noci di acagiù, noci di pecan, noci del brasile 9. Sedano e prodotti a base di sedano 10.Senape e prodotti a base di senape 11.Semi di sesamo e prodotti a base di semi di 12.Anidride solforosa e solfiti 13.Lupini e prodotti a base di lupini 14.Molluschi e prodotti a base di molluschi 5

6 .E I LIMITI DI LEGGE..??????? Ad oggi i limiti di legge sono chiaramente definiti solamente per due tipologie di allergeni: GLUTINE: 20 mg/kg (ppm) per gli alimenti GLUTEN FREE 100 mg/kg (ppm) per gli alimenti VERY LOW GLUTEN SOLFITI: 10 mg/kg (ppm) per gli alimenti SOLFITE FREE 6

7 Quali allergeni R&C èin grado di determinare?? Glutine Latte Senape Sedano Noce Mandorla Sesamo Anacardo Orzo Pistacchio Soia Arachide Nocciola Pesce Crostacei Molluschi Lupino Lattosio Solfiti 7

8 Tecniche analitiche adottate E.L.I.S.A. PCR ENZIMATICI TITRIMETRICI 8

9 Campioni analizzati 9

10 CARATTERISTICHE delle METODICHE ADOTTATE PRECISIONE ACCURATEZZA SENSIBILITA SPECIFICITA RIPRODUCIBILITA 10

11 E.L.I.S.A (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - Principio- Consente la determinazione della proteina allergizzante (caseina, beta-lattoglubulina, gliadina, etc.) Si basa sulla reazione ANTIGENE - ANTICORPO Utilizzata per rilevare la presenza di un determinato ANTIGENE in un campione in analisi (nel campo degli allergeni molto spesso l antigene èuna proteina). L ANTICORPO èuna glicoproteina con una caratteristica struttura quaternaria che gli conferisce una forma a: COMPETITIVO NON COMPETITIVO 11

12 E.L.I.S.A (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - Procedimento analitico - Estrazione con tampone opportuno Eventuale procedimento di diluizione del campione estratto Esecuzione del Kit 12

13 E.L.I.S.A (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - Procedimento analitico - Caricamento dei campioni e dei reattivi nella piastra Lettura spettrofotometrica Concentrazione analita Intensità colore 13

14 PCR (Reazione a catena della Polimerasi) - Principio - Consente di individuare il DNAdella specie che produce l ALLERGENE E una tecnica che permette la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di DNA 14

15 FASI DELLA METODICA Estrazione del DNA dal campione in analisi Introduzione del DNA nel termociclatore (fase di amplificazione) Caricamento del DNA amplificato sul gel di agarosio Lettura con lampada UV 15

16 TITRIMETRIA (Solfiti) - Principio - Si utilizza una titolazione acido/base per determinare l analita ricercato Si applica una metodica ufficiale: UNI EN Limite da rispettare per essere considerato un prodotto SULPHITE FREE: 10 mg/kg Limite di rilevabilitàdel laboratorio: 5 mg/kg 16

17 TITRIMETRIA (Solfiti) - Procedimento analitico - 50 g ca di campione omogeneizzato Trasferire il campione in un pallone e far gorgogliare azoto aggiungere 100 ml di miscela H 2 O/EtOH aggiungere lentamente HCl conc Riscaldare il pallone con isomantello e attendere per 105 min Far gorgogliare l SO 2 in una soluzione di H 2 O 2 17

18 TITRIMETRIA (Solfiti) - Procedimento analitico - Soluzione di H 2 O 2 Soluzione di H 2 O 2 in presenza di SO 2 Fine titolazione dopo agg di NaOH 18

19 Kit ENZIMATICI - Principio - Una sostanza in presenza di un enzima specifico èconvertita in un altra in presenza di un coenzima NADH che a sua volta passa, durante la reazione, dalla forma ossidata NAD + alla forma ridotta NADH. Il NADH presenta un massimo di assorbimento a 340 nm L analisi enzimatica è utilizzata per determinare composti come: Zuccheri (es. Lattosio) Acidi organici Alcoli Altri metaboliti 19

20 KIT ENZIMATICI - Procedimento analitico - Estrazione con acqua calda Reazione dell estratto con b-galattosidase (formazione di galattosio) D-galattosio + NAD + acido D-galattonico + NADH 20

21 .E ALLORA E.L.I.S.A SENSIBILITA SPECIFICITA RAPIDITA PCR SPECIFICITA SENSIBILITA Titrimetria ACCURATEZZA RIPRODUCIBILITA PRECISIONE Kit ENZIMATICI SPECIFICITA SENSIBILITA 21

22 GRAZIE A TUTTI PER L ATTENZIONEL 22

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