LA GESTIONE DEGLI ALLERGENI IN AUTOCONTROLLO

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Geronimo Ricci
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1 LA GESTIONE DEGLI ALLERGENI IN AUTOCONTROLLO Enrico Pavoni Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia Romagna-Brescia Roma 25/09/2013

2 Ruolo degli IIZZSS Supporto agli organi di controllo (es: ASL, SIAN, UVAC, PIF), alle imprese (autocontrollo), ai consumatori (informazione e comunicazione) Sviluppo di nuove metodiche (sempre più sensibili) E.L.I.S.A.

3 CARATTERISTICHE DEI METODI DI ANALISI 1) MASSIMA SENSIBILITA 2) ELEVATA SPECIFICITA 3) STANDARDIZZABILI

4 RICERCA DIRETTA DELLE PROTEINE ALLERGENICHE (E.L.I.S.A) DETECTION ALLERGENI RICERCA DEL GENE CODIFICANTE (Real Time PCR)

5 E.L.I.S.A. Standard elevati nella qualità dei controlli

7 No cross-reazioni

8 L omogeneizzazione fondamentale buona riuscita analisi: minimo 50 g di matrice da omogeneizzare per processarne 0,25 1 g Soluzioni di estrazione (ß-mercaptoetanolo, guanidina cloridrato, etanolo, PBS, Extraction additives ) Attraverso la rottura dei legami S-S, possono essere distrutte sia la struttura terziaria che la struttura quaternaria della proteina. L etanolo denatura le proteine e le disidrata.

Extraction additives ) Attraverso la rottura dei legami S-S, possono essere distrutte sia la

9 ANALISI IN AUTOCONTROLLO (ELISA): Gliadina, uovo PASTA, FARINE (materie prime), PRODOTTI DA FORNO, IMPASTI, PIATTI MENSE Gliadina PARTICOLE, SUPERALCOLICI, DENTIFRICI, INSACCATI, SFARINATI DI SORGO, QUINOA, MAIS, AVENA

10 ß-lattoglobuline, INSACCATI, PRODOTTI DELLA PASTICCERIA, SORBETTI arachide, nocciola, mandorla PASTE, BISCOTTI, CIOCCOLATA CASI CLINICI

11 ESPRESSIONE DEL RISULTATO: Glutine QUANTITATIVA C C E R I D O T TA

12 ESPRESSIONE DEL RISULTATO: ß-Lattoglobuline QUALITATIVA LOD = LOQ A C C E R I D O T TA

13 ESPRESSIONE DEL RISULTATO: Proteine uovo QUALITATIVA A C C E R I D O T A T

14 VA I L O T A D

accettabilità della prova: OSS: Non risultano evidenti

15 NON CONFORMITA e OSSERVAZIONI EVIDENZIATE ACCREDEIA NC: Non sono stati effettuati controlli per la verifica dell' accettabilità della prova: OSS: Non risultano evidenti registrazioni delle validazioni dei fogli di calcolo come previsto al p.to 13.3 del MQ

16 REAL TIME PCR Pesce Soia Crostacei Molluschi Pistacchio Sesamo Sedano Lupino* Arachide* *Allergia crociata anche grave (30-60% allergici all arachide)

17 ESTRAZIONE DEL DNA biglie magnetiche REAL TIME PCR qualitativa MORTADELLA SENZA PISTACCHIO (pistacchio) IMPASTI PIZZE (farina di lupino) ERBE PER ARROSTI, SPEZIE (sedano, soia) ALIMENTI SOSPETTI PER CASI CLINICI (tutto il pannello)

IMPASTI PIZZE (farina di lupino) ERBE PER ARROSTI, SPEZIE

18 PCR: Polymerase Chain Reaction PCR: 2n filamenti n= numero cicli Dopo 30 cicli: 230= 1,07x109 > 1 miliardo di molecole identiche

19 REAL TIME PCR Chimica della TaqMan: La Pol trova come ostacolo la sonda TaqMan: R vicino a Q, non c è emissione La Pol comincia a rimuovere la sonda TaqMan (5 esonucleasi) Rottura della sonda: R si allontana da Q ed emette fluor. La Pol completa la polimerizzazione: il DNA è raddoppiato

sonda TaqMan (5 esonucleasi) Rottura della sonda: R si allontana da Q

20 INTERPRETAZIONE dei RISULTATI L emissione di fluorescenza e proporzionale alla quantita di DNA

21 REAL TIME QUALITATIVE PCR FAM R SONDA TAMRA Q

22 Esperienze di laboratorio: pistacchio Cross reattività con Anacardiaceae (es. Pepe, mango), noci e nocciole PEPE id o n vo Fla i!

23 SPEZIE ED ERBE AROMATICHE contengono inibitori PCR Soluzione: DNA t.q. DNA 1:5-1:10 Diluendo il DNA diluisco gli inibitori

24 E.L.I.S.A o PCR: COSA E MEGLIO?

26 Finalità Autocontrollo N 3225 Matrice Campionamento Autocontrollo giugno 2012 giugno PASTA ALIMENTARE SECCA 108 CAMPIONI AMBIENTALI 86 ALTRE PREPARAZIONI ALIMENTARI 70 CARNE E INSACCATI 27 ALTRI ADDITIVI 9 ALIMENTI PRONTI COTTI 4 ADDITIVI 4 AMIDO 4 ALTRE CARNI 4 CAFFE' 2 PRODOTTI DELLA PASTICCERIA E BISCOTTERIA 1 SPEZIE 1 ACQUA 209 ALTRE MATRICI

27 Pastificio in autocontrollo: Pasta normale Pasta gluten free STESSE LINEE DI PRODUZIONE MA IN PERIODI DIVERSI Pasta senza uovo Pulizia accurata ambienti di lavoro nei cambi di produzione Pasta con uovo Glutine: CAMPIONI AMBIENTALI (piastre Petri per apposizione) Trabatto 2 minuti di esposizione Raffraddatore 5 minuti di esposizione Silos carico pasta gluten free 10 minuti di esposizione

28 Uscita silos stoccaggio gluten free 15 minuti Nastro trasporto 30 minuti 9 ore Ponte esposizione 60 sec Stenditrice 50 secondi

29 Sfilatrice 40 sec Preincarto 5 minuti Nastro trasporto tazze 2 minuti Silo pasta lunga ore

30 Risultati autocontrollo ALLERGENE GLUTINE ß-LATTOGLOBULINE UOVO TOTALE Non rilevato* *Limite di quantificazione glutine = 5ppm. Limite di quantificazione ß-latto = 0.5 ppm. Limite di quantificazione uovo = 2.5 ppm. FINALITA AUTOCONTROLLO Rilevato* TOTALE

31 Finalità Attività di conferma per altro Ente N 6 2 SOGLIOLA 1 ALTRE PREPARAZIONI ALIMENTARI 1 CALAMARI 1 ROMBO/HALIBUT 58 1 FILETTO DI ORATA Attività di controllo NAS Matrice 9 PASTA ALIMENTARE SECCA 7 BISCOTTI 4 FARINA 3 OMOGENEIZZATI DI FRUTTA PER LO SVEZZAMENTO 3 ALTRI INTEGRATORI 3 RAGU' 3 PREPARAZIONI PER ZUPPE, MINESTRE O BRODI 3 ERBE INFUSIONALI 2 ARROSTO DI TACCHINO 2 PASTICCERIA ARTIGIANALE DA FORNO 2 PRODOTTI PRIVI DI GLUTINE 1 OMOGENEIZZATI DI FRUTTA PER LO SVEZZAMENTO 1 PANE GRATTUGIATO 1 CRACKERS 1 AMIDO 1 ZUCCHERO BIANCO Campionamento Ufficiali giugno 2012 giugno 2013

32 Finalità Piano Regionale Alimenti (Emilia Romagna) N Matrice PRODOTTI DA FORNO 71 ALIMENTI PRONTI COTTI 16 CARNE E SALUMI Prelievo con finalità non definita 8 PRODOTTI ITTICI PRODOTTI PRIVI DI GLUTINE 3 PANE 2 DOLCI 2 PASTA ALIMENTARE SECCA 2 FETTE BISCOTTATE, CRACKERS, GALLETTE ED AFFINI 2 PREPARAZIONI GASTRONOMICHE 1 CRACKERS 1 PASTA COTTA 1 BISCOTTI 1 CRACKERS 194 Tossinfezioni Totale 1 Campionamento Ufficiali/non giugno 2012 giugno analisi

33 N ANALISI <5ppm ppm<valore<20ppm 66 20ppm valore<80ppm 25 TOTALE 2678 PRODOTTI DA FORNO O PASTICCERIA TAMPONI / PIASTRE PER APPOSIZIONE ALIMENTI PRONTI COTTI PREPARAZIONI ALIMENTARI (2,5%) (1,5%) MATRICE PASTA ALIMENTARE SECCA PREPARAZIONI GASTRONOMICHE SALSE INTEGRATORI PRODOTTI DIETETICI CAFFE' AMIDO CIOCCOLATO INSACCATI PRODOTTI ITTICI CARNE E DERIVATI ADDITIVI VERDURA, FRUTTA, CEREALI FORMAGGI ALTRO TOTALE Risultati generali glutine giugno 2012 giugno 2013.

34 Glutine: PIASTRE PER APPOSIZIONE Lavaggio 10 ml Et-OH 60% No cocktail solution (Mendez) 980 µl sample diluent 1X + 20 µl sample ELISA GLUTINE mg/70cm2 TEMPO ESPOSIZIONE (h) SILO PASTA LUNGA > SILO PASTA LUNGA 15,7 24 SILO PASTA LUNGA 37,9 48 SILO PASTA LUNGA 28,8 72 SILO PASTA LUNGA 43,3 96 SILO PASTA LUNGA 47,4 116 SCARICA SEMOLA* 5,9 6 *Contaminazione volontaria

35 MATRICE ACQUA ALTRI MATERIALI SALUMI PASTICCERIA E BISCOTTERIA TAMPONE TOTALE MATRICE ALTRE SPEZIE PASTICCERIA E BISCOTTERIA FARINA FORMAGGIO GRATUGGIATO PASTA ALIMENTARE SECCA INSACCATI TAMPONE DA ATTREZZATURA TOTALE N Non rilevate (<0,5ppm) ANALISI Rilevate ( 0,5ppm) TOTALE N Non rilevate (<2,5ppm) Risultati generali ß-Lattoglobuline giugno 2012 giugno Risultati generali ANALISI Rilevate ( 2,5ppm) TOTALE (5,2%) 3 57 proteine dell uovo giugno 2012 giugno 2013.

36 Conclusioni Glutine: 5 mg/kg < 2,5% < 20 mg/kg 20 mg/kg < 1,5% < 80 mg/kg Proteine uovo: 5,2% > 2,5 mg/kg ß-Lattoglobuline: / I prodotti alimentari italiani possono essere considerati safe

37 WORK IN PROGRESS Corresponds to 0,13 mg/kg (ppm) egg white protein)

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