Chimica delle cianotossine e metodi di rilevamento

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1 Chimica delle cianotossine e metodi di rilevamento Simona Scardala e Mara Stefanelli Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Reparto Qualità degli Ambienti Acquatici e delle Acque di Balneazione Roma gennaio 2011

2 CIANTSSINE CIANBATTERI EFFETT DISTRIBUZINE Microcistine Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Nostoc, Anabaenopsis; Snowella, Woronichinia Acuto: Epatotossico Cronico: Promotori tumorali Ubiquitari Molto comuni in acque dolci Cilindrospermopsina Cylindrospermopsis, Anabaena, Umezakia, Aphanizomenon, Raphidiopsis Acuto: Danni a tessuti e organi particoalmente fegato Cronico: Possibili cancerogeni Notifiche in aumento specie nei climi caldi Anatossine Anabaena, Planktothrix, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Raphidiopsis Acuto: Neurotossico Acque dolci: scarsamente ritrovata Anatossina-a(s) Anabaena Acuto: Neurotossico Acque dolci: molto scarsamente ritrovata Nodularine Nodularia Acuto: Epatotossico Cronico: Promotori tumorali Acque salmastre Sorgenti termali d acqua dolce Saxitossine Anabaena, Planktothrix, Aphanizomenon, Lyngbya, Cylindrospermopsis Acuto: Neurotossico In acque dolci riportato in America, Australia ed Europa BMAA Da letteratura risulta presente nel 95% delle specie testate Cronico: Neurotossico Ubiquitario Lipopolisaccaridi Tutti i cianobatteri Acuto: Infiammazioni Possono interferire con i meccanismi di detossificazione Ubiquitario 2

3 Una volta effettuato il campionamento Come conservare i campioni fino all analisi?

4 Le MC, ND e CYL degradano alla luce soprattutto in presenza di detriti cellulari Anatossina-a ed omoanatossina degradano rapidamente alla luce anche in assenza di pigmenti (1-2 ore) In acque dolci le saxitossine persistono fino a 90 giorni e non sembrano essere degradate da batteri, tuttavia a T ambiente si può verificare la conversione di tossine C in dcgtx In generale la degradazione microbica delle cianotossine viene in genere rallentata da condizioni refrigerate Sempre per le Saxitossine il congelamento dei campioni, utilizzato spesso anche per favorire la lisi cellulare, stimola l epimerizzazione (C-2 C-3; GTX-3 GTX-1) 4

5 Contenitori La CYL viene fortemente assorbita dal polietilene, evitare quindi tali contenitori nel campionamento e/o stoccaggio Anche le MC vengono adsorbite da alcuni materiali plastici come il PVC Sempre per le MC preferire contenitori in vetro scuro alla plastica se si utilizza un rivelatore UV. La plastica può rilasciare additivi che assorbono a 238nm e che vengono facilmente coeluiti con le MC Ikawa et al., Toxicon 37 (1999)

6 Molti metodi in letteratura per MC applicabili anche a ND (acque salmastre) Pochi metodi per ATX, CYL e BMAA STX rappresenta una eccezione poiché molto diffusa in mare: molti metodi di estrazione da molluschi e crostacei. Sono tuttavia poche le applicazioni di tali metodi ad acque dolci 6

7 Estrazione con solvente (bloom, tessuti) Estrazione in fase solida (campioni acquosi) ANALISI STRUMENTALE 7

8 Microcistine e nodularine Me 5 C H 3 N CH 3 CH 3 N H CH 6 X 4 CH 3 N CH CH 2 H 3 C H N CH N 1 Y 2 MC sono eptapeptidi monociclici con una grande varietà strutturale 1. D-ala 2. Y 3. D-erythro-β-methylAsp 4. X 5. Adda 6. D-Glu 7. N-methyldehydroAla MC-LR: 2: Leucina (L) 4: Arginina (R) Possibili demetilazioni in posizione 3 e 7 ND: Famiglia di pentapeptidi ciclici Al contrario delle mc esistono poche varianti (es. demetilazioni nelle posizioni indicate) CH 3 C H 3 CH 3 CH 3 NH N H CH N H N CH 3 CH 3 N CH NH CH 2 CH 3 HN NH 2 8

9 Tossicità di alcuni Congeneri Y X 3 7 LD 50 µg/kg MC-LR Leucina Arginina CH3 CH dem (Dha7) MC-LR Leucina Arginina CH3 H dem (D-Asp3) MC-LR Leucina Arginina H CH3-980 MC-RR Arginina Arginina CH3 CH dem (Dha7) MC-RR Arginina Arginina CH3 H dem (D-Asp3) MC-RR Arginina Arginina H CH MC-LA Leucina Alanina CH3 CH MC-YR Tirosina Arginina CH3 CH MC-LY Leucina Tirosina CH3 CH MC-LF Leucina Fenilalanina CH3 CH3-985 MC-LW Leucina Triptofano CH3 CH MC-RA Arginina Alanina CH3 CH MC-FR Fenilalanina Arginina CH3 CH MC-WR Triptofano Arginina CH3 CH dem (D-Asp3) MC-FR Fenilalanina Arginina H CH MW Sono stati identificati più di 80 congeneri differenti 9

10 Bloom, tessuti Molti solventi utilizzati Prevalentemente MeH Campioni acquosi C18, carbone grafitato, polimeriche, immunoaffini HPLC-UV, -PDA LC-MS, MS/MS 10

11 IS 20179:2005 Water quality - Determination of microcystins - Method using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet (UV) detection IS 20179:2005 specifies a method for the determination and quantification of microcystins in raw water (containing biomass) and treated water, such as tap water. The method described is validated for MCYST-RR, MCYST-YR and MCYST- LR. It is also applicable for the determination of several structure variants of these microcystins, but an unambiguous identification cannot be made due to the lack of commercially available standards and due to coelution. 11

12 Con rivelatori UV le MC e la ND assorbono a nm, per le varianti che contengono amminoacidi aromatici, come la MC-LW che contiene un triptofano, l assorbimento massimo si ha a lunghezze d onda inferiori, a 222nm. Molte sostanze coeluiscono con le MC e assorbono alla stessa lunghezza d onda. In tali casi rivelatori come il DAD consentono di identificare le MC ma non di distinguerne le varianti L identificazione inequivocabile delle MC si ottiene solo con rivelatori di massa, sia MS che MS/MS. Tali metodiche si sono rivelate fondamentali nell identificazione sia delle MC note che delle nuove varianti 12

13 RT: 2.20? Demetil-MC-RR fioritura [M+2H] [M+2H] RT: 2.26 MC-RR Mix 0.5 μg/l 13

14 Estrazione da tessuti animali 14

15 I recuperi possono variare dal 15 al 105% in funzione di: Procedura di estrazione utilizzata Tipo di tessuto estratto Congeneri ricercati 15

16 Effetto matrice MC che non contengono Arginina (R) sono risultate molto più suscettibili alla formazione di addotti con Na + e K + LR [M+H] + [M+2H] 2+ RR [M+Na] + LW [M+H] + LA [M+H] + [M+Na] + Ruiz et al. (2005)hanno rilevato per la MC-RR una sovrastima del 15% estraendo da reni ed una sottostima del 37% estraendo da fegato

17 Cilindrospermopsina Alcaloide guanidinico Peso molecolare 415 u.m.a. Contrariamente alle microcistine durante il bloom sembra che una larga parte della tossina sia in forma disciolta Standard disponibili solo per la Cilindrospermopsina deossicilindrospermopsina 7-epi-cilindrospermopsina 17

18 Bloom, tessuti MeH, CH 3 CH:H 2 :HCH H2 Campioni acquosi carbone grafitato HPLC-UV, - PDA (poco sensibile richiede elevate concentrazioni) LC-MS, MS/MS (iniezione diretta) 18

19 Anatossine Anatossina-a Ammina secondaria biciclica a peso molecolare 165 u.m.a. moanatossina mologo della anatossina-a dalla quale differisce per la presenza in C2 di un propionile anziché un acetile H N CH 3 H N CH 3 La spettrometria di massa ha evidenziato la presenza di prodotti di degradazione che sono diidro ed epossi derivati delle tossine originali La Anatossina-a non risulta sia mai stata individuata in ceppi produttori di moanatossina-a e viceversa Standard disponibili solo per l Anatossina 19

20 Bloom, tessuti H 2, H 2 acidificata, MeH acidificato miscele MeH/H 2 Campioni acquosi C18 (campione basico), debole scambio cationico, carbone grafitato HPLC-UV, -PDA, -FLD (previa derivatizzazione) LC/MS, MS/MS (iniezione diretta) 20

21 H N CH 3 Fenilalanina Stesso peso molecolare: 166 amu Anatossinaa Simile pattern di frammentazione 149, 131, 107, 91 Simili tempi di ritenzione Le abbondanze dei diversi frammenti sono comunque diverse Hanno tuttavia λ max differenti 227 e 257 nm rispettivamente oltre che spettri UV differenti

22 Anatossina-a (s) Estere fosforico della N-idrossi guanidina Unica tossina appartenente agli organofosfati prodotta dai cianobatteri Non sono state identificate varianti strutturali Non sono disponibili standard Impossibile usare HPLC- UV per l assenza di gruppi cromofori Sviluppo di pochissimi metodi in LC-MS ed LC-MS/MS Il metodo più utilizzato rimane comunque il saggio di inibizione dell acetilcolinesterasi data l assoluta assenza di standard Falsi positivi per interferenze da insetticidi organo fosforici 22

23 PSP Non solfate R4 Tossina R1 R2 R3 R4 STX H H H CNH 2 NE H H H CNH 2 R1 H 2 N N N R2 H N Alcaloidi neurotossici N H H H R3 NH 2 Mono solfate Tossina R1 R2 R3 R4 GTX-1 H H S 3 - CNH 2 GTX-2 H H S 3 - CNH 2 GTX-3 H S 3 - H CNH 2 GTX-4 H S 3 - H CNH 2 GTX-5 H H H CNHS 3 - GTX-6 H H H CNHS 3 - Esistono tre classi principali di PSP Tossina R1 R2 R3 R4 Bisolfate: C-tossine (minor tossicità) C-1 H H S 3 - CNHS 3 - C-2 H S 3 - H CNHS 3 -

24 Bloom, tessuti HCl, CH 3 CH Campioni acquosi debole scambio cationico, carbone grafitato HPLC-FLD (previa derivatizzazione) LC/MS 24

25 DIN EN 14526:2004 Foodstuffs - Determination of saxitoxin and dc-saxitoxin in mussels - HPLC method using pre-column derivatization with peroxide or periodate oxidation The document specifies an HPLC method for the determination of saxitoxin and dicarbamoylsaxitoxn in mussels with pre column derivatization. Saxitoxin and DC-saxitoxin are strongly neuro-toxic substances produced by algae which are accumulated in mussels and which are harmful for the human body. In order to ensure the consumer's health, it is necessary to analyse the amount of saxitoxin and DC-saxitoxin in mussels and to check whether the regulation 91/472 is fulfilled. 25

26 Solventi previsti HCl o CH3CH HCl a caldo: Porta alla parziale idrolisi di alcune varianti (C-1, C-2, GTX-5) nelle più tossiche (GTX-2, GTX-3, saxitossina). Lo stesso processo avviene più o meno anche nello stomaco. Questa estrazione potrebbe essere quindi il giusto approccio per stimare la potenziale tossicità di un campione CH3CH a freddo: procedura meno aggressiva che mantiene praticamente intatto il profilo delle tossine presenti nel campione. Viene applicata nello sviluppo di materiale di riferimento per le tossine PSP 26

27 Conclusioni Allo stato attuale i principali ostacoli da superare sono l assenza di: Standard certificati Medoti standardizzati Materiale certificato In attesa della standardizzazione dei metodi ogni laboratorio è tenuto a fare le analisi secondo le proprie possibilità Fornendo dettagli sul metodo utilizzato e sulla efficienza di estrazione sarà anche possibile confrontare dati prodotti da laboratori diversi 27

28 Chimica delle cianotossine e metodi di rilevamento Simona Scardala e Mara Stefanelli Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Reparto Qualità degli Ambienti Acquatici e delle Acque di Balneazione Roma gennaio 2011

29 Screening di campioni ambientali Per una analisi più rapida delle cianotossine possono essere impiegati: Metodi biologici (Saggi in vivo: MBA,Daphnia) Metodi biochimici (Phosphatase Inhibition Assay ) Metodi immunoenzimatici (Enzyme Linked Immunosorbend Assay) Qualitativi e/o semiquantitativi Livelli di sensibilità variabili a seconda del metodo usato A risposta rapida Non necessitano di standard analitici Non discriminano tra le varie tossine

30 Metodi biologici: saggi in vivo P R Screening iniziale (identifica la presenza di qualsiasi tossina) Relativamente veloce e poco costoso Di facile applicazione Fornisce indicazioni di tossicità Vertebrati: Mouse BioAssay C N T R Bassa sensibilità Utilizzo di un discreto numero di animali: problemi etici Metodo esclusivamente qualitativo (tossicità si/no) Preclude l identificazione di effetti ritardati (letalità/sub letalità) Somministrazione poco rappresentativa della reale esposizione umana P R Facilmente reperibile in commercio Costi limitati Facile esecuzione 24-48h per la risposta (saggio acuto) No problemi etici Invertebrati: es. Daphnia magna C N T R Metodo qualitativo (tossicità si/no) Aspecifico Allevamento laborioso Misura di tossicità totale del campione In alcuni casi del tipo di tossina presente (in base ai sintomi o in seguito a necrosi)

31 Metodi biologici Metodi biochimici e immunoenzimatici più sensibili (es. 0,1 g/l per MC) più veloci dei metodi chimici meno costosi in grado di determinare la presenza di tossine, indipendentemente dalla disponibilità di standard

32 Metodi Biochimici: Phosphatase Inhibition Assay (PPi) Principio: microcostine e nodularina sono forti inibitori di proteine (serina/treonina) fosfatasi, classificate in due gruppi: - Tipo 1: PP1 - Tipo 2: PP2 Livello di inibizione dipende dalla concentrazione di tossina La quantificazione della inibizione può essere fatta con tre tecniche (3 metodiche: p- nitrofenil fosfato; 4-metil-umbelliferilfosfato; 32P) P R sensibilità variabile (32P: LD 0,1 g/l MCs) non è richiesta concentrazione del campione relativamente poco costosi rileva quantità totale di epatotossina C N T R solo per epatotossine (no distinzione tra varianti) breve emivita del P radioattivo (circa 14giorni) difficoltà di molti laboratori di lavorare con radioattivo (possibilità di utilizzare gli altri substrati)

33 Metodi immunoenzimatici: Enzyme Linked Immunosorbend Assay (ELISA) Il metodo utilizza anticorpi policlonali o monoclonali, immobilizzati sulle pareti di un sistema test, che possono legare sia le cianotossine che un coniugato enzima cianotossine In ogni pozzetto è contenuta una quantità nota di anticorpi immobilizzati Un campione che contiene una bassa concentrazione di CTox permette all anticorpo di legare un alto numero di molecole di coniugato Alte concentrazioni di CTox nel campione consentono ad un basso numero di molecole di coniugato di legarsi agli anticorpi La rivelazione dei complessi si ha per via colorimetrica, con una relazione inversa che lega intensità di colore e concentrazione di CTox legate Il dosaggio si basa sulla lettura dell assorbanza (450 nm)

34 Si dividono in: Test per competizione diretta Test per competizione indiretta Fase a: Fissato al substrato un anticorpo specifico per l antigene che vogliamo ricercare Fase b: Aggiunta campione biologico da testare per verificare la presenza dell antigene (legame anticorpo-antigene) Fase c: Inserimento di un secondo anticorpo marcato che lega il primo Fase a: Campione biologico direttamente legato al substrato Fase b: Inserimento di anticorpi conosciuti per reagire contro l antigene (legame anticorpo-antigene) Fase c: Inserimento di un secondo anticorpo marcato che lega il primo

35 Metodi Immunoenzimatici Sono disponibili sul mercato diversi kit diagnostici per microcistine/nodularina, saxitossine e cilindrospermopsina Strips, in forma di piastre da 96 pozzetti, con anticorpo adeso sul fondo Controllo negativo Calibratori a diverse concentrazioni (ppb) Diluente Coniugato Soluzione di lavaggio Substrato Soluzione Stop

36 STEP saggio ELISA per campioni di acqua preparazione del campione: lisi cellulare e rilascio tossine* allestimento dei pozzetti: almeno 2 per ogni campione (incubazione 30 min) (coniugato) legame del complesso marcato anticorpo-enzima reazione di competizione (incubazione 30min) lavaggio * (substrato) reazione cromogenica (incubazione 30min) (soluzione stop) Dosaggio (es. microcistine) Conc. MC-LR (log) La quantificazione avviene per confronto/estrapolazione con una curva standard *, costruita con la MC- LR, nella quale si riportano in scala semilogaritmica le concentrazioni di MC-LR vs % della assorbanza dello standard rispetto alla assorbanza del controllo negativo (B0%) * Punti critici

37 KIT ELISA : Microcistine e nodularina Diversi Kit disponibili in commercio (LQ: 0.1-5ug/L) Non si richiede pre-concentrazione del campione Determinazione di Microcistine/nodularina TTALI Tossine Tossicità relative Cross reattività MC- LR 1 100% MC- YR 0,7 64% MC-RR 0,1 53% MC-LA 1 48% Nodularina 1 76% N-hemi-ADDA / 38% ADDA / 15% Buona sensibilità ma cross reattività (con congeneri e prodotti di degradazione: ADDA): SVRASTIMA Studi per produzione di nuovi anticorpi policlonali e monoclonali (ma costosi per attività routinaria)

38 KIT ELISA: Saxitossine Disponibili Kit in commercio per saxitossina e neosaxitossina (LQ:0,02-0,4ug/L) Non richiede pre-concentrazione del campione Stesso KIT per campioni ambientali diversi: acqua, mitili, etc Tossine Tossicità relative Cross reattività C / C / C / GTX <0.2% GTX % GTX % GTX % STX 1 100% dcgtx % dcgtx % Buona sensibilità ma limitata cross-reattività: sono specifici per SXT ma poco cross-reattivi con altri epimeri : STTSTIMA

39 KIT ELISA: Cilindrospermopsina Qualche Kit disponibile in commercio (LQ: 0,05-2ug/L) Stesso KIT per campioni ambientali diversi: acqua, tessuto e plasma di pesci Non richiede pre-concentrazione del campione Ancora poche informazioni in letteratura

40 I metodi immunoenzimatici sono considerati: SEMIQUANTITATIVI I kit disponibili non sono in grado di discriminare tra le molecole parentali e i coniugati che però hanno quasi sempre tossicità minore La non distinzione tra tossina e congeneri può portare ad una sovrastima o sottostima della concentrazione e della potenziale tossicità del campione: aspetto rilevante per l interpretazione di dati in termini di valutazione tossicologica

41 MA Disponibilità dei Kit in commercio Relativamente poco costosi Analisi mediante una ridotta quantità di campione Sono rapidi (ca.2 ore / > 40 campioni) Buona sensibilità Hanno un accuratezza ed una precisione idonei allo scopo Il saggio ELISA è un metodo efficace e praticabile che può essere utile come primo screening (conferma dei campioni positivi necessita comunque di metodi più precisi )

42 GRAZIE PER L ATTENZINE