TEST BIOLOGICI E FUNZIONALI PER IL RILEVAMENTO DELLE PALITOSSINE

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1 A L G O L A B TEST BIOLOGICI E FUNZIONALI PER IL RILEVAMENTO DELLE PALITOSSINE Rossella Pistocchi e Aurelia Tubaro Anna Milandri, Marco Pelin e Silvio Sosa

2 Test biologici e funzionali Possono essere di diverso tipo: Saggi con organismi in vivo biologici Saggi di citotossicità Saggi biochimici funzionali Saggi immunologici

3 Utilità Possono essere utili come screening preliminari cui far seguire le analisi strumentali o nel caso in cui i metodi strumentali non siano disponibili. Le metodiche di screening devono garantire una sensibilità adeguata al livello tossicologico di interesse, semplicità nell esecuzione e possibilità di analizzare velocemente e a basso costo un gran numero di campioni.

4 Test in vivo con organismi Organismi modello più utilizzati: Mammiferi Crostacei Riccio di mare Pesci Mouse test (Artemia salina, Daphnia magna, Tigriopus fulvus, Amphibalanus amphitrite) (Paracentrotus lividus) (Dicentrarchus labrax)

5 Utilità dei test biologici I test biologici hanno il vantaggio di: identificare effetti tossici dovuti alla presenza di eventuali tossine non note o non attese riportare la tossicità totale del campione

6 SAGGI RIPORTATI SULLE LINEE GUIDA PER O. cf. ovata MOUSE BIOASSAY SAGGIO CON ARTEMIA SALINA

7 Saggio con Artemia salina Nei saggi effettuati con O. cf. ovata, A. salina è risultato l organismo modello più sensibile Organismi LC 50-48h (cell ml -1 ) 20 C LC 50-48h (cell ml -1 ) 25 C A. salina 12 <4 T. fulvus A. amphitrite (Faimali et al. 2011) D. labrax (stadi giovanili) muoiono entro 3 giorni con concentrazioni di O. cf. ovata (colture) tra 425 e 2367 cell ml -1 (Pezzolesi et al. 2012) Con campioni ambientali la LC 50 per D. labrax è di 540,7 cell ml -1 a 96h (Faimali et al. 2011) A. salina evidenzia tossicità inferiore al valore soglia di cell ml -1

8 Saggio con Artemia salina L elevata sensibilità si osserva soprattutto con cellule vive in quanto i valori di EC50 aumentano con cellule lisate o estratti di cellule (Pezzolesi et al. 2012)

9 Saggio con Artemia salina L elevata sensibilità per O. cf. ovata si osserva anche dal confronto con altre alghe tossiche Species Toxins EC 50-24h (cell ml -1 ) Ostreopsis ovata Ovatoxins 8 Fibrocapsa japonica Ichtyotoxins Alexandrum minutum Saxitoxins Protoceratium reticulatum Yessotoxins Prorocentrum lima Okadaic acid 2740 Coolia monotis None/Unknown nd Phaedactylum tricornutum None nd

10 Saggio con Artemia salina Tuttavia il test è aspecifico e può dare falsi positivi per la presenza di altre sostanze. Species Toxins EC 50-24h (cell ml -1 ) Ostreopsis ovata Ovatoxins 8 Gonyaulax fragilis None (mucilage) 5360 Prorocentrum lima Okadaic acid 2740 P. lima Okadaic acid without mucilage nd

11 Ulteriori osservazioni Artemie: E stata osservata sensibilità diversa tra diversi batch di A. salina per cui è necessario l uso di organismi certificati E necessario che le artemie abbiano raggiunto tutte lo stadio di sviluppo in cui si nutrono Alghe: La presenza contemporanea di O. cf. ovata e altre specie non tossiche è risultata in una minore tossicità per le artemie Non ha evidenziato differenze fra ceppi o colture con diverso livello di tossicità

12 SAGGI CITOTOSSICI E FUNZIONALI RIPORTATI SULLE LINEE GUIDA PER O. cf. OVATA SAGGIO EMOLITICO SAGGI DI CITOTOSSICITA SAGGI DI IMMUNOFLUORESCENZA SAGGI IMMUNOENZIMATICI BIOSENSORI

13 Utilità dei test funzionali I test funzionali hanno il vantaggio di: presentare elevata sensibilità, specificità e semplicità nell esecuzione poter essere sviluppati in forma di kit permettendo di analizzare velocemente e a basso costo un gran numero di campioni

14 Saggio emolitico Si basa sulla capacità della PLTX di causare un emolisi ritardata concentrazione-dipendente degli eritrociti di diverse specie animali L emolisi viene quantificata misurando l assorbanza di emoglobina liberata dalle cellule Può mostrare specificità tramite inibizione con ouabaina

15 Saggio emolitico VANTAGGI: E di facile esecuzione Possiede elevata sensibilità Ha mostrato correlazione con le tossine analizzate con LC-MS Haemolysis (%) Haemolysis (%) 100 (A) salinity salinity 26+OUA 80 salinity salinity 32+OUA 50 salinity salinity 36+OUA salinity 40 salinity 40+OUA cell ml C 20 C+OUA 25 C 25 C+OUA 30 C 30 C+OUA (Pezzolesi et al. 2012)

16 Saggio emolitico SVANTAGGI: Può risentire dell effetto matrice Può dare origine a falsi positivi E necessario sangue animale fresco con implicazioni logistiche e etiche

17 Saggi di citotossicità Evidenziano la morte cellulare o la perdita di funzionalità cellulare indotta dalla PLTX Vantaggi: Possono essere usate linee cellulari stabilizzate (Neuro2a, MCF7) Hanno elevata sensibilità Possono fornire una quantificazione Svantaggi: Possono dare falsi positivi per la presenza di altre sostanze o tossine

18 Saggi di immunofluorescenza Sono basati sull uso di anticorpi in grado di riconoscere le PLTX/OVTX Vantaggi: Sono molto sensibili con LoD molto bassi Hanno mostrato specificità per le ovatossine Svantaggi: Sono metodi laboriosi

19 Vantaggi: Saggi immunoenzimatici Utilizzano anticorpi e si basano sulla affermata tecnica ELISA In grado di rilevare PLTX sotto il limite stabilito dall EFSA Altamente specifico per gli analoghi della PLTX Accurato, preciso e ripetibile Gli estratti di mitili hanno mostrato solo modeste interferenze Svantaggi: Gli anticorpi non sono in commercio (Boscolo et al. 2013)

20 Biosensori Rappresentano un evoluzione nell uso di anticorpi. Ne sono stati ideati due: Uno basato sul metodo immunoenzimatico di Boscolo et al. (2013) che rileva le tossine tramite emissione di elettro-chemiluminescenza. L altro è basato sulla tecnica di Surface Plasmon Resonance. Vantaggi: Sono sensibili e specifici, il primo ha basso LoD e LoQ anche nei mitili Sono facili da usare, riutilizzabili e portatili

21 Sviluppo dei test con colture Per la messa a punto del test occorre utilizzare una popolazione omogeneamente dispersa, di dimensioni e caratteristiche fisiologiche costanti in quanto: La tossicità aumenta di 4-5 volte nel passaggio dalla fase esponenziale di crescita a quella stazionaria Le cellule più piccole sono meno tossiche o perché si stanno dividendo attivamente o perché si trovano in carenza di nutrienti Ceppi diversi presentano composizione delle tossine diverse Toxin conc (pg cell -1 ) OVTX-a OVTX-b OVTX-c OVTX-d,e ppltx Time (day)

22 Rossella Pistocchi Dipartimento di Scienze Biologiche, Geologiche e Ambientali rossella.pistocchi@unibo.it