Valutazione del rischio sanitario per esposizione a cianotossine Enzo Funari e Emanuela Testai

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1 Valutazione del rischio sanitario per esposizione a cianotossine Enzo Funari e Emanuela Testai Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Istituto Superiore di Sanità- Roma 1 Convegno Cianobatteri ISS Novembre 2007

2 Vie di esposizione per l uomo Via di esposizione Orale Mezzo acqua potabile acque ad uso ricreazionale cibo (prodotti ittici,latte,carne, verdure) supplementi alimentari Polmonare aerosols, spray in attività di ricreazione, lavoro, doccia Cutanea attività di ricreazione, lavoro, doccia Emodialisi acqua usata per emodialisi

3 Valutazione esposizione Proprietà chimiche e profilo tossicologico del rischio per a cianotossine Scenari, vie e livelli di esposizione

4 Cianotossine Le cianotossine includono : epatotossine (microcistine, nodularina) citotossine (cilindrospermopsina) neurotossine (anatossina-a, anatossina a-(s), saxitossina, neosaxitossina), endotossine lipopolisaccaridiche (LPS) Aplisiatossina, lingbiatossina, microviridina J, BMAA Le cianotossine note ad oggi rappresentano verosimilmente soltanto una parte di quelle esistenti

5 Microcistine Le microcistine (MC) sono eptapeptidi monociclici MC-LR (5) ADDA Posizione 2: Arginina MC-RR Tirosina : MC-YR

6 Biodisponibilità delle MC (I) La MC-LR ha elevata idrofilicità che impedisce il passaggio attraverso le membrane biologiche per diffusione passiva. La MC-LR nei mammiferi viene assorbita a livello intestinale grazie al sistema di trasporto degli anioni organici. Attraverso il circolo portale viene trasportata al fegato e veicolata all interno degli epatociti dal sistema di trasporto degli acidi biliari. Al fegato, principale organo bersaglio dell azione delle MC ingerite, si distribuisce circa il 50-70% della dose di esposizione.

7 Biodisponibilità delle MC (II) Le MC sono resistenti all idrolisi enzimatica Vengono escrete nelle urine e nelle feci come tossine tal quali o come coniugati con il glutatione e con la cisteina I coniugati sono meno tossici del parentale

8 Tossicità acuta delle MC Le MC sono potenti epatotossine La MC-LR è considerata il congenere con la più elevata tossicità acuta. MC-LR: DL50 ip - topo: µg/kg pc. MC-RR: DL50 ip - topo: 600 µg/kg pc MC-LR: DL50 orale topo: µg/kg pc (superiore nel ratto) La morte si verifica entro breve tempo (1-2 ore dalla somministrazione)

9 La differenza di tossicità acuta di volte nelle 2 vie di somministrazione (i.p/orale) è dovuta a differenze tossicocinetiche. I sistemi di trasporto attivo per l assorbimento intestinale vengono by-passati dal trattamento i.p.. La MC-LR diventa direttamente disponibile per il trasporto all interno della cellula epatica. Somministrazione i.p.: poco rappresentativa delle reali condizioni di esposizione umana per via orale (cibi e/o acqua potabile).

10 MC: Meccanismo di azione Le MC agiscono a livello epatico come inibitori delle fosfatasi proteiche 1 e 2A (PP1 e PP2A). eventi a Ad alte dosi di MC (tox acuta) cascata (cambiamenti nel citoscheletro, stress ossidativo, apoptosi, aumento della trascrizione di alcuni geni) tossicità epatica centrolobulare, zone altamente emorragiche per danneggiamento dei sinusoidi epatici. A basse dosi di MC (tox ripetuta) induzione di proliferazione cellulare e ipertrofia epatica

11 MC: Tossicità ripetuta 13 settimane- topo- gavaggio: NOAEL di 40 µg/kg pc/giorno; LOAEL= 200 µg/kg pc al giorno (effetti poco rilevanti su un numero limitato di animali ) 45 giorni topo- via orale (dieta): NOAEL di 333 µg /kg pc/giorno Le differenze possono essere attribuite alla tossicocinetica delle due vie di somministrazione. Gavaggio introduzione di una dose bolo: alte concentrazioni circolanti e tissutali, Dieta graduale nel tempo: eventuali sistemi di detossificazione e/o riparo possono intervenire.

12 MC: Altri effetti tossici Le MC non sono dotate di tossicità riproduttiva e dello sviluppo Non c e interazione diretta con il DNA, responsabile di attività genotossica. Se somministrata da sola la MC-LR non ha alcuna attività cancerogena Sono state dimostrate proprietà di promotore tumorale della MC-LR La IARC ha classificato la MC-LR come cancerogeno 2B

13 Nodularina La nodularina (NOD) è una pentapetide monociclico, con struttura simile alle microcistine.

14 Tossicità acuta delle Nodularine Le Nodularine (NOD) sono potenti epatotossine Sono noti meno di 10 congeneri di NOD. DL50 ip - topo: µg/kg pc ( la morte sopraggiunge in 2-3 h). Le NOD agiscono a livello epatico come inibitori delle fosfatasi proteiche 1 e 2A (PP1 e PP2A). Si ottiene un quadro di tossicità epatica centrolobulare, simile a quello indotto da MC.

15 NOD: Altri effetti tossici Non sono disponibili dati di tossicità ripetuta su NOD. Non è stata dimostrata attività di iniziatore dopo somministrazione in vivo di NOD. Non è nota attività genotossica primaria Sono state dimostrate proprietà di promotore tumorale della NOD La IARC non ha considerato i dati disponibili sufficienti per classificare le NOD

16 Cilindrospermopsina La cilindrospermopsina (CYN) appartiene alla classe degli alcaloidi guanidinici. La molecola è costituita da un gruppo guanidinico triciclico combinato con idrossimetil-uracile.

17 Tossicocinetica della CYN La CYN ha elevata idrofilicità. Necessita di trasporto attivo (trasportatori degli acidi biliari per gli epatociti). Per le ridotte dimensioni può attraversare parzialmente le membrane biologiche per diffusione passiva. Nel topo viene escreta per via renale (>50% in 6h) Viene bioattivata dal P450 e probabilmente coniugata con GSH

18 Tossicità acuta della CYN La CYN ha effetti epatotossici e nefrotossici. Altri organi (timo, polmone) possono risultare danneggiati. La tossicità acuta è ritardata e progressiva: la morte si verifica a h (1-2 h per le MC). LD50 topo-ip : 2.1 mg/kg a 24 h LD mg/kg a 5-6 gg ( h) topo-orale : mg/kg a 2-6 gg

19 CYN: Meccanismo di azione La CYN agisce direttamente come inibitore della sintesi proteica I metaboliti formati dal P450 agiscono con un meccanismo diverso non noto In epatociti in coltura la CYN induce danni al DNA solo in seguito ad attivazione metabolica. Possibile attività genotossica?

20 CYN: Tossicità ripetuta 11 settimane-topo- gavage-cyn pura: NOAEL =30 µg/kg pc/g (basato su aumento di peso del rene alla dose superiore = 60 µg/kg pc/g) Dati preliminari in vivo indice di potenziale attività cancerogena (tumori epatici): topi per via orale con 500 e 1500 μg/kg pc estratto di C. raciborskii (1 dose ogni 2 settimane per 3 volte) + 10 μg TPA, 2 volte a settimana (30 sett) basso numero di animali, assenza di dose dipendenza, assenza di significatività

21 Struttura chimica delle neurotossine La Anatossina a è un alcaloide amminico biciclico La Omoanatossina-a differisce dalla anatossina-a per la presenza di un addizionale gruppo metilico. La Anatossina-a (s) ha una struttura chimica diversa, essendo un estere fosforico della N-idrossi guanidina.

22 Struttura chimica delle saxitossine La molecola della Saxitossina (STX) ha le caratteristiche di un carbammato con il sostituente in posizione 4 = CONH2. E parte del gruppo delle tossine note come PSP (Paralytic Shellfish Poison)

23 Anatossina-a : Tossicità acuta E un potente agente depolarizzante pre- e postsinaptico. Si lega ai recettori dell acetilcolina nel SNC e periferico e nelle giunzioni neuromuscolari, con blocco della trasmissione dell impulso nervoso. La morte sopraggiunge per paralisi muscolare e asfissia. DL50 topo i.v.< 100 µg/kg pc DL50 topo i.p. = 375 µg/kg pc DL50 topo orale > µg/kg pc E assorbita rapidamente dal sistema g.i., si

24 Anatossina-a:Tossicità ripetuta 14 gg topo gavaggio NOAEL = 1500 µg/kg pc/g 28 gg topo gavaggio NOAEL >120 µg/kg pc/g (nessun effetto alla dose più alta saggiata). 54 gg ratto orale (drinking water) NOAEL >510 µg/kg pc/g (nessun effetto alle 2 dosi = alla dose più alta saggiata) Gli effetti acuti sembrano rappresentare il principale rischio per la salute umana

25 Anatossina-a(s): Tossicità acuta L anatossina-a(s), analogamente agli insetticidi organofosforici, inibisce la attività acetilcolinesterasica ma solo nel sistema nervoso periferico. Bloccandone l idrolisi, l acetilcolina si accumula e determina iper-eccitabilità nervosa. DL50 topo i.p. = µg/kg pc (tempo di sopravvivenza 5-30 min) La attività colinesterasica cerebrale resta normale anche a dosi letali

26 Saxitossine: Tossicità acuta Le STX bloccano la trasmissione dell impulso nervoso nei nervi periferici e nei muscoli scheletrici, con conseguente paralisi muscolare (cuore incluso) e respiratoria. DL50 topo i.p. = 10 µ g/kg pc DL50 topo orale = 263 µg/kg pc Sono facilmente assorbibili a livello GI e bioaccumulabili in alcuni organismi marini (non si hanno dati sui mammiferi) Sono permeabili alla barriera ematoencefalica Non sono disponibili studi di tossicità ripetuta

27 Le endotossine LPS Associazione tossine LPS effetti topici (irritazione di pelle, occhi, mucose, e problemi g.i.) o reazioni allergiche mai dimostrata sperimentalmente e ipotizzata in analogia agli effetti dovuti alle LPS dei batteri Gram-negativi

28 Procedure per il Risk Assessment Studio di tossicità rilevante ed effetto critico (dati sull uomo e/o su animali) NOAEL animali NOAEL uomo Nessun fattore di incertezza Estrapolazione Animali/uomo (uomo considerato più sensibile) Variabilità interspecifica UF=10 UF= uncertainty factor

29 Variabilità interspecifica UF=10 + Variabilità intraspecifica UF=10 Fattore di incertezza 10x10 =100 Qualità del dato/assenza di dati di tox cronica/gravità dell effetto UF=2-30 Fattore di incertezza totale : da applicare al NOEL per il calcolo del MOS o della dose accettabile per l uomo capace di proteggere dagli effetti tossici anche gli individui più sensibili

30 Calcolo della TDI/ADI TDI/ADI= dose giornaliera accettabile= dose che può essere ingerita da varie fonti per tutto l arco della vita ogni giorno senza alcun rischio apprezzabile per la salute. TDI totale= NOAEL UF TDI parziale= proporzione della TDI attribuibile ad una singola fonte di esposizione = TDI tot x AF AF (allocation factor) = contributo % alla TDI totale

31 TDI della MC-LR NOEL subcronico - topo = 40 μg (kg pc x g)-1 (scelta conservativa = NOEL più basso) UF= 10 variabilità interspecifica ( TK: trasportatori per anioni organici uomo/roditori; TD: sensibilità tra le specie) 10 variabilità intraspecifica 10 assenza di dati di tox cronica (2 secondo il nuovo TGD europeo per il RA; fattore 3 aggiuntivo per la promozione tumorale) TDI= NOEL/1000 =0.04 μg (kg pc x g)-1

32 TDI (provvisoria) della CYN NOEL subcronico - topo = 30 μg (kg pc x g)-1 UF= 10 variabilità interspecifica 10 variabilità intraspecifica 10 assenza di dati di tox cronica (fattori aggiuntivi per eventuali effetti irreversibili, se confermati) TDI= NOEL/1000 =0.03 μg (kg pc x g)-1 Pari a 1.8 μg/d per persona adulta di 60kg

33 Superamenti dei valori guida e della TDI Permanente: potrebbe rappresentare un rischio significativo (dipende dai livelli di superamento e dai fattori di incertezza nel calcolo della TDI) ed è opportuno intervenire sulla fonte per ridurre l esposizione. Sporadico: non rappresenta necessariamente un rischio significativo; necessità del giudizio di un esperto tossicologo, eventuali interventi sulla fonte.

34 Valutazione del rischio acuto No acute effect level = NO(A)EL acuto UF MC-LR: NOEL Acuto i.p. : μg/kg. Fattore di incertezza =100 (variabilità inter- & intraspecifica) Fattore di correzione: X 10 (per tenere conto della differenza di volte tra la via i.p. e quella orale) No acute effect level = 25 X 10 = 2.5 μg/kg 100 quindi circa 150 μg per un adulto di 60 kg

35 Valutazione del rischio subcronico La Dose acuta di riferimento che viene derivata per quei prodotti con elevata tossicità acuta, o con altri effetti significativi (neurotossicità, tossicità dello sviluppo) in seguito ad esposizioni ripetute ma per tempi brevi. Si proteggono popolazioni che in dipendenza della stagionalità consumano alte quantità di alimenti contenenti residui NOEL subcronico - topo = 30 μg (kg pc x g)-1 UF= 10 variabilità interspecifica 10 variabilità intraspecifica ARfD= NOEL/100 =0.3 μg (kg pc x g)-1 Pari a 18 μg/d per persona adulta di 60kg

36 Le cianotossine nell acqua potabile Le cianotossine possono contaminare l acqua potabile quando siano utilizzate come fonti di approvvigionamento acque contenenti cianobatteri. I livelli dipendono strettamente dall entità della loro presenza nelle acque grezze e dalla efficienza dei metodi utilizzati per il trattamento e dalla loro efficacia nella rimozione delle cellule e delle tossine disciolte. Trattamenti adeguati permettono una riduzione della concentrazione >99%

37 MC-LR e acqua potabile Si stima che l 80% della ingestione totale di MC-LR avvenga attraverso il consumo di acqua potabile : AF = 0.8 Consumo giornaliero: si assume che sia 2 L al giorno per un adulto di 60 kg di peso. Il valore guida dell OMS per l acqua potabile GV =0.04 μg (kg x g)-1 x 60 kg x μg /L 2 L/g

38 Acqua potabile (1) Effetti acuti esposizione a concentrazioni di cianotossine relativamente elevate dovute alle caratteristiche di rilascio delle tossine, alla lisi di una fioritura sia naturale che indotta (es. uso di algicidi) o dalla inefficienza dei sistemi di trattamento. Trattamento efficace basso Assenza di trattamento acuto Valori di Intake< 2.5 μg/kg rischio acuto molto possibile rischio Nessun rischio Necessità di definire misure di mitigazione del rischio tailored-made (inclusa l informazione alla popolazione)

39 Acqua potabile (2) Effetti cronici esposizioni ripetute a bassi livelli Valori guida OMS (GV) = massima concentrazione ammissibile nell acqua potabile MC-LR TDI= 0.04 µg/kg bw/day GV= TDI x peso x AF = 0.04 µg/kg x 0.8 x 60kg 1 µg/l consumo giornaliero (C) 2L Anatoxin-a TDI provvisoria = 0.51 µg/kg bw/day Per valori GV GV provvisorio 12 µg/l CYN TDI= 0.03 µg/kg bw/day GV provvisorio 1 µg/l Nessun rischio cronico

40 Carni e latte Dieta (1) Le MC non si accumulano nelle carni e non sono trasportate al latte in bovini trattati con MC-LR. Vegetali Alcune piante possono trattenere MC se irrigate con acque interessate da forti fioriture (livelli fitotossici). Non accade se irrigate con acque con livelli ambientali di MC. L evento è episodico e limitato nel tempo. Si può raccomandare di non usare acque con fioriture per l irrigazione Rischio assente o molto basso

41 Dieta (2) Prodotti ittici Livelli di contaminazione riportati in letteratura MCs: MCs µg/kg in parti eduli di pesci, crostacei e molluschi CYN: CYN mg/kg in parti eduli di pesci, viscere and epatopancreas; STX: STX fino a 80 μg/100 g di muscolo Punti critici nella valutazione della esposizione: Misura del contenuto di cianotossine in in parti eduli di specie rappresentative per una adeguato periodo di tempo Differenze nell accumulo di cianotossine nelle varie specie. Caratteristiche del bacino Caratteristiche nella dieta della popolazione locale

42 Dieta (3) Prodotti ittici : Rischio acuto MCs: MCs worst case: 370 μg/kg in parti eduli di carpa. Considerando un consumo episodico di 300 g, l intake è: 100 μg/persona minore del No acute effect level dose Consumo di 20g viscere Rischio acuto inaccettabile o 100 g di mollusco

43 Dieta (4) Prodotti ittici : Rischio acuto STX: STX EU Directive 91/492/EEC limite per le tossine PSP in molluschi bivalvi 80 μg STX eq/100 g di muscolo per proteggere i consumatori dal rischio acuto sulla base di : μg STX/persona >450 μg STX/persona sintomi lievi di intossicazione intossicazione severa Considerando 80 μgstx/100 g e g di consumo medio: L intake = μg/100 g il margine di sicurezza verso i sintomi lievi è 1 e minore di 1 per effetti molto marcati. Possibile rischio acuto

44 Dieta (5) Prodotti ittici : Rischio cronico MCs: MCs μg/kg (range valori in parti eduli) e consumo medio giornaliero di 200 g di pesce l intake è: 0.05 μg/persona/d 20 μg/persona/d minore della TDI (2.4 μg/per/d) Rischio cronico inaccettabile Prodotti ittici : Rischio subcronico (stagionale) MCs: MCs μg/kg (range valori in parti eduli) e consumo medio giornaliero di 200 g di pesce l intake è: 0.05 μg/persona/d minore della ARfD (24 μg/per/d) 20 μg/persona/d Rischio subcronico limitato

45 Integratori alimentari Ottenuti da Aphanizomenon flos-aquae and Spirulina spp consumo fino a 20 g /d Livelli di MC-LR fino 35µg/g (alta % 1 µg/g d. w.) Intake= 700 µg/person/day 5 volte NOEL acuto Rischio acuto inaccettabile worst case 250-volte la TDI Rischio cronico inaccettabile 25 volte il valore di ARfD Rischio subcronico inaccettabile

46 Attività ricreazionali Le attività ricreazionali possono rappresentare una fonte di esposizione a cianobatteri/cianotossine attraverso il contatto diretto, l inalazione e/o l ingestione. Questo tipo di esposizione non è generalmente associato ad un rischio cronico. Effetti Topici contatto diretto pelle e mucose irritazione, associata a LPS endotoxins or altre sostanze (aldeidi, chetone, terpenoidi) formati durante il bloom Effetti Sistemici assorbimento cutaneo di tossine (limitato da idrofilicità) ingestion involuntaria/accidentale (es: nuoto) Effetti gravi ai bagnanti possibili solo quando sono presenti fioriture e schiume.

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