Workshop ISS: Sorveglianza delle fioriture di cianobatteri nelle acque di balneazione: approccio per l applicazione del DL 30 maggio 2008 n.
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- Marina Fabiani
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1 Valutazione del rischio associato alla esposizione alle cianotossine nelle acque di balneazione Emanuela Testai Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Istituto Superiore di Sanità- Roma 1 Workshop ISS: Sorveglianza delle fioriture di cianobatteri nelle acque di balneazione: approccio per l applicazione del DL 30 maggio 2008 n.112 in recepimento della direttiva 2006/7EC Maggio 2009
2 Vie di esposizione per l uomo Via di esposizione Orale acqua potabile Mezzo acque ad uso ricreazionale cibo (prodotti ittici,latte,carne, verdure) supplementi alimentari Polmonare Cutanea Emodialisi attività di ricreazione, lavoro, doccia attività di ricreazione, lavoro, doccia acqua usata per emodialisi
3 Valutazione del rischio per esposizione a cianotossine in attività ricreative La stagionalità delle fioriture rende difficile una esposizione cronica le specie con fioriture invernali limitano le possibilità di esposizione associata a balneazione in regioni con fioriture persistenti e attività sportive/ricreative prolungate scenari tipici da rischio subacuto/subcronico possono rappresentare un rischio sanitario
4 Valutazione del rischio per esposizione i a cianotossine i Proprietà chimiche e profilo tossicologico Scenari, vie e livelli lli di esposizione + Effetti topici i Effetti sistemici i i
5 Cianotossine Effetti topici endotossine lipopolisaccaridiche (LPS) Aplisiatossina, i i lingbiatossina i Effetti sistemici epatotossine (microcistine, nodularina) citotossine (cilindrospermopsina) neurotossine (anatossina-a, anatossina a- (s), () saxitossine, BMAA). Ma la divisione non è così netta.
6 Le endotossine LPS Parte esterna : + NH carboidrati 3 HO polimerici (Catena O- specifica) O + OH O -O O P O O O NH C O C O O O C O O O -O O O OH O P NH O O O O- P O O O- O NH 3 + Regione centrale liposaccaridica H 3 C C H 3 C H 3 H 3 C C H 3 Regione interna glicolipidica : LIPIDE A H 3 C Componenti delle membrane cellulari dei cianobatteri e dei batteri gramnegativi. Le differenze nella subunità esterna nei batteri causano la specificità ità serologica: anche il lipide id A è variabile. Le LPS dei cianobatteri i differiscono leggermente da quelle batteriche e contengono fosfati nelle catene esterne CH 3
7 Associazione tossine LPS effetti topici (irritazione di pelle, occhi, mucose, e gastroenteriti) o reazioni allergiche/ infiammatorie mai dimostrata sperimentalmente e ipotizzata in analogia agli effetti dovuti alle LPS dei batteri Gram-negativ negativi Legame a recettori di membrana cascata di eventi (rilascio di citochine/mediatori dell infiammazione infiammazione, macrofagi attivati, aggregazione di neutrofili e piastrine, danni vascolari). Il lipide A è responsabile della tossicità e la sua variabilità determina il livello di tossicità (da nullo ad alto) La struttura del lipide A dei cianobatteri non è nota e perciò non è possibile trarre conclusioni sul grado di tossicità.
8 Risultati di test di sensibilizzazione cutanea indicano che estratti di cianobatteri inducono diversi gradi di sensibilizzazione indipendentemente dalla produzione di altre cianotossine (Torokne et al., 2001) Possibile ruolo delle endotossine LPS Durante bloom di cianobatteri i si formano molti altri composti organici (aldeidi, chetoni e terpenoidi) che si dissolvono in acqua, hanno una certa volatilità e spesso sono dotati di attività irritante e sensibilizzante. Possibile presenza e/o sinergia di fattori eziologici diversi e concorrenti.
9 I frammenti di parete cellulare dei cianobatteri aerosilazzano con facilità La loro inalazione può contribuire re sia per la presenza di tossine LPS sia per azione di irritazione meccanica ai sintomi conosciuti come flue-like like symptoms caratterizzati da tosse, raffreddore, laringite e febbre. Nessuna associazione è stata chiaramente definita e qualsiasi conclusione sugli effetti inalatori di tossine LPS è prematura
10 Aplisiatossina & Lyngbiatossina Indicate come responsabili di dermatiti da contatto (swimmer s s itch) ) alle Hawaii e di intossicazioni per il consumo di una tartaruga marina Chelonia midas, la cui carne è risultata contaminata nel Pacifico e in Madagascar (414 persone intossicate con 29 decessi negli anni : gastriti, ulcerazioni della mucosa buccale e della lingua, irritazione e danni gravi alla mucosa g.i., diarrea, mal di testa e febbre) Il meccanismo è legato all effetto topico sulle mucose, con dilatazione dei vasi linfatici, congestione dei capillari che portano ad emorragie nell intestino tenue
11 Effetti topici di altre tossine Sospensioni acquose di estratti di fioriture di Microcystis e Anabaena (microcistine) leggero potenziale irritativo per pelle e occhi; risultati positivi per la sensibilizzazione cutanea. Nessuna correlazione con il contenuto di MC La MC pura non ha potere irritativo ed è un sensibilizzante molto debole sensibilizzante molto debole Estratti di colture axeniche danno risultati negativi Gli effetti topici (pelle e occhi) delle MC non sono rilevanti
12 Effetti topici di altre tossine Estratti liofilizzati di Aphanizomenon ovalisporum potenziale di irritazione it i cutanea moderato della CYN nel coniglio Estratti liofilizzati di C. raciborskii (produttori di CYN) e di un ceppo non tossico di Aphanizomenon risultato positivo nel test di sensibilizzazione cutanea in entrambi i casi Gli effetti topici (pelle e occhi) della CYN non sono rilevanti
13 Effetti topici sull uomo Sono stati descritti: effetti acuti in seguito ad attività di balneazione (irritazioni cutanee, riniti, congiuntiviti, asma, orticaria- sintomi assimilabile a reazione infiammatorie/allergiche-, mal di testa, febbre, mialgia, vertigini, e ulcerazioni alle mucose buccali) Un episodio di sintomi respiratori anche gravi attribuiti a inalazione in 10 su 20 soldati a seguito di attività prolungata (8-12 ore) di nuoto e canottaggio in un bacino affetto da una forte fioritura di Microcystis Sono valide le considerazioni fatte per le tossine LPS
14 Effetti sistemici Dovuti a: assorbimento delle cianotossine per via cutanea (limitato per le caratteristiche di idrosolubilità di molte MC e per la grandezza della molecola che limita l assorbimento passivo, presumibilmente limitato per la CYN, non noto ma possibile per le piccole neurotossine) assorbimento in seguito ad inalazione di aerosol (mai dimostrato fino ad ora) ingestione accidentale o involontaria per via orale (es: nuotando o giocando-per i bambini)
15 Effetti sistemici sull uomo Un unico caso di decesso associazione a posteriori da parte di un medico legale negli USA per esposizione a anatoxin-a La morte di un ragazzo attribuita a ingestione accidentale di acqua di un laghetto in un campo da golf (effetti sistemici) La tossina presente nel sangue e nelle feci misurata post mortem Incertezze legate alla lunga latenza tra esposizione e decesso (circa 48 ore)
16 Effetti sistemici su animali Diagnosi di intossicazione da ATX and HTX in cani dopo aver fatto il bagno (e bevuto) in Scozia, Francia, Irlanda, Nuova Zelanda e USA. Nella maggior parte dei casi si tratta di acque di fiume e di lago interessate da fioriture di specie bentoniche come Phormidium sp. and Oscillatoria sp.. Queste specie formano biofilm che si attaccano sulle superfici (massi e ciotoli) ma anche sul pelo dei cani. L esposizione è aumentata e prolungata nel tempo a causa dell abitudine di dei cani di leccarsi il pelo
17 Microcistine Le microcistine (MC) sono eptapeptidi monociclici MC-LR (5) ADDA Posizione 2: Arginina MC-RR Tirosina : MC-YR
18 Tossicità acuta delle MC Le MC sono potenti epatotossine La MC-LR è considerata il congenere con la più elevata tossicità acuta. MC-LR: DL 50 ip - topo: µg/kg pc. MC-RR: DL 50 ip - topo: 600 µg/kg pc MC-LR: DL 50 orale topo: µg/kg pc (superiore nel ratto) La morte si verifica entro breve tempo (1-2 ore dalla somministrazione) i i
19 MC: Meccanismo di azione Le MC agiscono a livello epatico come inibitori delle fosfatasi f proteiche 1 e 2A (PP1 e PP2A). Ad alte dosi di MC (tox acuta) eventi a cascata (cambiamenti nel citoscheletro, stress ossidativo, apoptosi, aumento della trascrizione di alcuni geni) tossicità epatica centrolobulare, zone altamente emorragiche per danneggiamento dei sinusoidi epatici. A basse dosi di MC (tox ripetuta) induzione di proliferazione cellulare e ipertrofia epatica
20 MC: Tossicità ripetuta 13 settimane- topo- gavaggio: NOAEL di 40 µg/kg pc/giorno; LOAEL= 200 µg/kg pc al giorno (effetti poco rilevanti su un numero limitato di animali ) 45 giorni topo- via orale (dieta): NOAEL di 333 µg /kg pc/giorno Non c e interazione diretta con il DNA assenza di attività genotossica primaria Se somministrata da sola la MC-LR non ha alcuna attività cancerogena Sono state dimostrate proprietà di promotore tumorale della MC-LR La IARC ha classificato la MC-LR come cancerogeno 2B
21 Nodularina La nodularina (NOD) è una pentapetide monociclico, con struttura tt simile il alle MC. Gli effetti tossici sono sovrapponibili a quelli delle MC
22 Cilindrospermopsina La cilindrospermopsina (CYN) appartiene alla classe degli alcaloidi guanidinici. La molecola è costituita da un gruppo guanidinico triciclico combinato con idrossimetil-uracile uracile. OH -O 3 S O H 3 C N C + NH HN NH HN O
23 Tossicità acuta della CYN La CYN ha effetti epatotossici t i e nefrotossici. i Altri organi (timo, polmone) possono risultare danneggiati. La tossicità acuta è ritardata e progressiva: la morte si verifica a h (1-2 h per le MC). LD 50 topo-ip p : 2.1 mg/kg g a 24 h 0.2 mg/kg a 5-6 gg ( h) LD topo-orale : mg/kg a 2-6 gg LD 50
24 CYN: Meccanismo di azione La CYN agisce direttamente come inibitore della sintesi proteica I metaboliti formati dal P450 agiscono con un meccanismo diverso non noto In epatociti in coltura la CYN induce danni al DNA solo in seguito ad attivazione metabolica. Possibile attività genotossica? 11 settimane-topo- gavage-cyn pura: NOAEL =30 µg/kg g pc/g (basato su aumento di peso del rene alla dose superiore = 60 µg/kg pc/g) Non essitono dati affidabili sulla potenziale attività cancerogena
25 Le neurotossine
26 Neurotossine : Tossicità acuta Sono tutte attive nel bloccare la trasmissione dell impulso nervoso: la morte sopraggiunge per paralisi muscolare e asfissia. ATX e HTX : potenti agenti depolarizzanti pre- e post- sinaptici (legame ai recettori dell acetilcolina nel SNC e periferico i e nelle giunzioni i ni neuromuscolari) DL 50 topo i.p. = 375 µg/kg pc DL 50 topo orale >5.000 µg/kg pc ATX(s): inibitore delle acetilcolinesterasi solo nel SNP accumulo di acetilcolina iper-eccitabilità eccitabilità nervosa. DL 50 topo i.p. = µg/kg pc La attività colinesterasica cerebrale resta normale anche a dosi letali
27 Neurotossine : Tossicità acuta STX : Bloccano la trasmissione dell impulso nervoso nei nervi periferici i i nel cuore e nei muscoli scheletrici i (blocco dei canali del sodio nei neuroni e di Ca e K nei muscoli) DL 50 topo i.p. = 10 μ g/kg pc DL 50 topo orale = 263 μg/kg pc La tossicità varia tra i congeneri : le saxitossine con struttura di carbammato sono le più tossiche, quelle prodotte da L. wolley hanno una tossicità acuta minore del 15% di quella della STX. Nell organismo I congeneri subiscono interconversioni.
28 Anatossina-a:Tossicità ripetuta 14 gg topo gavaggio NOAEL = 1500 µg/kg pc/g 28 gg topo gavaggio NOAEL >120 µg/kg pc/g (nessun effetto alla dose più alta saggiata). 54 gg ratto orale (drinking water) NOAEL >510 µg/kg pc/g (nessun effetto alle 2 dosi = alla dose più alta saggiata) Gli effetti acuti sembrano rappresentare il principale rischio per la salute umana
29 Procedure per il Risk Assessment Studio di tossicità rilevante ed effetto critico (dati sull uomo e/o su animali) NOAEL uomo NOAEL animali Nessun fattore di incertezza Estrapolazione Animali/uomo (uomo considerato più sensibile) Variabilità interspecifica UF=10 UF= uncertainty factor
30 Variabilità interspecifica UF=10 + Variabilità intraspecifica UF=10 Fattore di incertezza 10x10 =100 Qualità del dato/assenza di dati di tox cronica/gravità dell effetto: da 2 in su Fattore di incertezza totale : 100- da applicare al NOEL per il calcolo l del MoS o della dose accettabile per l uomo capace di proteggere dagli effetti tossici anche gli individui più sensibili
31 Calcolo della TDI/ADI TDI/ADI= dose giornaliera accettabile= dose che può essere ingerita da varie fonti per tutto l arco della vita ogni giorno senza alcun rischio apprezzabile per la salute. TDI totale= NOAEL UF TDI parziale= proporzione p della TDI attribuibile ad una singola fonte di esposizione = TDI tot x AF AF (allocation factor) = contributo % alla TDI totale
32 TDI della MC-LR NOEL subcronico - topo = 40 μg (kg pc x g) -1 (scelta conservativa = NOEL più basso) UF= 10 variabilità interspecifica ( TK: trasportatori per anioni organici uomo/roditori; TD: sensibilità tra le specie) 10 variabilità intraspecifica 10 assenza di dati di tox cronica (2 secondo il nuovo TGD europeo per il RA; fattore 3 aggiuntivo per la promozione tumorale) TDI= NOEL/1000 =0.04 μg (kg pc x g) -1 Pari a 2.4 μg/d / per persona adulta di 60kg
33 Linee guida e limiti nelle acque potabili: MC-LR AF = 0.8 (si stima che l 80% della ingestione totale di MC-LR avvenga attraverso il consumo di acqua potabile-altre bl l fonti di esposizione orale: prodotti alimentari AF=0.2) 02) Consumo giornaliero: si assume che sia 2 L /g per un adulto. GV =0.04 μg (kg x g) -1 x 60 kg x μg /L 2 L/g
34 Superamenti dei valori guida e della TDI Permanente: potrebbe rappresentare un rischio significativo (dipende dai livelli di superamento e dai fattori di incertezza nel calcolo della TDI) ed è opportuno intervenire sulla fonte per ridurre l esposizione esposizione. Sporadico: non rappresenta necessariamente un rischio significativo; ifi necessità del giudizio i di un esperto tossicologo, eventuali interventi sulla fonte.
35 Valutazione del rischio acuto No acute effect level = NO(A)EL acuto UF MC-LR LR: NOEL Acuto i.p. : μg/kg. Fattore di incertezza =100 (variabilità inter- & intra- specifica) Fattore di correzione: X 10 (per tenere conto della differenza di volte tra la via i.p. e quella orale) No acute effect level = 25 X 10 = 2.5 μg/kg 100 quindi circa 150 μg per un adulto di 60 kg
36 Valutazione del rischio subcronico Il rischio subcronico è rappresentativo di esposizioni ripetute ma periodiche. Si proteggono per esempio popolazioni che in dipendenza della stagionalità consumano alte quantità di alimenti contenenti residui NOEL subcronico - topo = 40 μg (kg pc x g) -1 UF= 10 variabilità interspecifica 10 variabilità intraspecifica ARfD= NOEL/100 =0.4 μg g(gp (kg pc x g) -1 Pari a 24 μg/d per persona adulta di 60kg
37 Linee Guida OMS 2004 Le LG OMS derivano da uno studio epidemiologico condotto in Australia (Pilotto et al., 1997), nel quale tra 5000 e cellule/ml l l sono stati descritti lievi effetti irritativi in un numero molto limitato di persone rispetto agli esposti, senza correlazione con la concentrazione di MC-LR presente in acqua. A queste densità non è richiesta alcuna azione: rischio trascurabile Lo studio presenta alcuni limiti Specifico per MC-LR Basato solo su densità cellulari (assenza di cellule non significa assenza di rischio) Differenze tra sintomi in persone esposte e non solo dopo 7 giorni (allergia ritardata). Queste reazioni di solito compaiono 4-24 ore dopo l esposizione i all allergene Coorte a numerosità molto limitata (<100 persone)
38 Linee Guida OMS 2004 Bassa probabilità e/o lievi effetti nocivi per la salute umana (livello di sicurezza cellule/ml, per la protezione da effetti topici); L ingestione involontaria/accidentale i id t l di acqua (200 ml/giorno), comporterebbe l assunzione di µg di MC/giorno al valore guida stabilito dall OMS dalloms per le acque potabili Approccio conservativo: la TDI si riferisce ad un consumo gornalero giornaliero per tutta la vta, vita, che per la balneazione è uno scenario molto improbabile. Rispetto ad un rischio subcronico la dose ingerita sarebbe 10 volte inferiore.
39 Linee Guida OMS 2004 Probabilità moderata di effetti nocivi per la salute umana (livelloll di sicurezza cellule/ml), per la protezione da effetti topici e sistemici, dovuti ad ingestione accidentale. La concentrazione di MC può arrivare a 20 µg/l e l ingestione involontaria o accidentale di soli 100 ml di acqua/giorno corrisponderebbe alla TDI. A questi livelli è necessario intensificare le attività di monitoraggio perché possono rapidamente formarsi le schiume, che contengono concentrazioni di cianotossine anche 1000 volte superiori.
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