MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

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1 MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

2 MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI La marcatura degli acidi nucleici è una delle tecniche di base nello studio della Biologia Molecolare, rappresenta infatti una tappa preliminare per applicazioni inerenti lo studio di genomi come: - IBRIDAZIONE (Southern, Northern, Colony Ibridization ecc) - DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA - FOOTPRINTING - ANALISI DEI TRASCRITTI - ECC.

3 La marcatura del DNA La marcatura del DNA, in alternativa alla colorazione con Etidio Bromuro, rappresenta una modalità per la visualizzazione del DNA. La marcatura consente di determinare la posizione di una particolare molecola di DNA su una membrana di nylon o di nitrocellulosa, su un cromosoma o su un gel, individuando il segnale emesso dal marcatore e permettendone quindi la visualizzazione. Per alcune applicazioni vengono utilizzate anche molecole di RNA marcate. La marcatura è più sensibile della fluorescenza per cui sono necessarie quantità inferiori per la rivelazione.

4 ETIDIO BROMURO (FLUORESCENZA) AUTORADIOGRAFIA (RADIOATTIVITA )

5 ISOTOPI Un atomo è costituito da un nucleo carico positivamente circondato da una nuvola di elettroni carichi negativamente; nel nucleo sono presenti i protoni e i neutroni, la cui somma è detta numero di massa (A). Tuttavia gli atomi di un determinato elemento non contengono tutti lo stesso numero di neutroni, portando a variazioni di numero di massa. Atomi con differente numero di massa vengono detti ISOTOPI (radioattivi e pesanti). La stabilità di un isotopo dipende dal rapporto tra neutroni e protoni nel nucleo: esistono isotopi stabili (pesanti) e isotopi instabili che emettendo radiazioni e decadono nel tempo. Il decadimento è radiattivo, per cui tali isotopi vengono detti RADIOISOTOPI. Gli isotopi PESANTI invece si utilizzano nella centrifugazione in gradiente di densità (Messelson e Sthal con 15 N)

6 I radioisotopi utilizzati in biologia molecolare emettono radiazioni beta.

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8 A causa della pericolosità delle radiazioni occorre operare in condizioni di particolare attenzione. - Le manipolazioni vengono effettuate in un laboratorio apposito, detto dei radioisotopi, munito di cappe e docce per la decontaminazione. - Occorre inoltre proteggere occhi e mani mediante l utilizzo di schermi protettivi e guanti in lattice evitando qualsiasi contatto fisico con la sorgente di radiazioni, facendo attenzione a monitorare sempre con un contatore GEIGER l emissione della radioattività. - Lo smaltimento dei rifiuti avviene secondo norme ben precise e molto meticolose. - Le confezioni di radionuclidi ( 32 P, 35 S ecc) vanno conservati in contenitori di piombo e isolati da tutte le altre sostanze di laboratorio. Ecc. ecc.

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10 Il segnale radioattivo prodotto può essere quantificato mediante un contatore di scintillazioni (SCINTILLATORE), ma per la maggior parte delle applicazioni di biologia molecolare sono richieste informazioni posizionali che si ottengono tramite esposizione di una lastra sensibile ai raggi X (autoradiografia) o di uno schermo fluorescente sensibile alle radiazioni (phosphorimaging). Con 32 P si ottiene un elevata sensibilità perché questo isotopo ha un alta energia di emissione, ma ha una bassa risoluzione a causa della dispersione del segnale. Un isotopo a bassa emissione come 35 So 3 H dà una minore sensibilità ma una maggiore risoluzione.

11 Per marcare il DNA vengono utilizzati radioisotopi che entrano a far parte dei nucleotidi. E possibile sintetizzare nucleotidi in cui: - un atomo di fosforo è sostituito con P 32 oconp 33, - un atomo di ossigeno del gruppo fosfato è sostituito con S 35 - uno o più atomi di H sono sostituiti da H 3. Questi nucleotidi funzionano ancora come substrati per la DNA polimerasi e vengono incorporati in una molecola di DNA in sintesi. I nucleotidi marcati o i singoli gruppi P possono essere legati ad una estremità (marcatura esterna) o inseriti all interno della molecola (marcatura interna).

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15 La marcatura degli acidi nucleici può essere: -RADIOATTIVA ( O CALDA) -NON RADIOATTIVA (o FREDDA)

16 1-MARCATURA RADIOATTIVA

17 MARCATURA ALLE ESTREMITA Enzima di Restrizione CT GAATTC CTTAAG 3 TC + DNA Polimerasi + dntp + datp α 32 P TT** G AATTC CTTAA G** TT 3 5

18 γ β α

19 MARCATURA ALLE ESTREMITA 5 5 P 3 3 P * +Fosfatasi alcalina + Polinucleotide chinasi + ATP γ 32 P *

20 Si lega solo il fosfato marcato in γ sul nucleotide al 5 defosforilato

21 MARCATURA IN 5 DEGLI mrna 7-METIL-GUANOSINA α 32 P 5 5 mrna CONDENSAZIONE 5-5 GUANILIL TRANSFERASI + α 32 P GTP

22 FOOTPRINTING

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24 MARCATURA INTERNA - NICK TRANSLATION - RANDOM PRIMING

25 NICK TRANSLATION E' una reazione rapida ed efficiente per marcare uniformemente DNA a doppio filamento. La reazione si basa sull'attività sequenziale di due enzimi sulla molecola di DNA. La reazione ricalca quanto avviene in vivo per la riparazione dei danni del DNA batterico dovuto ai raggi UV. In una prima fase l'endonucleasi DNasi I produce su entrambi i filamenti un nick, cioè una rottura del legame 5'P - 3'OH tra due basi adiacenti. A questo punto si aggiunge la DNA polimerasi I con i 4 deossinucleotidi trifosfati (dntps di cui uno marcato in α) in un'opportuna miscela di reazione. La DNA polimerasi I si lega all'estremità 3' prodotta dall'attività endonucleotidica della DNasi I. Tale estremità funge da innesco per l'attività dell'enzima DNA polimerasi I che è caratterizzato anche da un attività esonucleotidica 5' -> 3' che elimina le basi non marcate che incontra sostituendole, grazie alla sua attività polimerasica, con le basi marcate presenti nella miscela di reazione. Il risultato finale della reazione sarà una molecola a doppia elica marcata in un alta percentuale dei suoi nucleotidi.

26 NICK TRANSLATION DNAsi DNA pol I + α 32 P datp Si ottengono molecole con elevata attività specifica.(>10 9 cpm/ug di DNA) La marcatura avviene su entrambe le eliche.

27 NICK TRANSLATION

28 RANDOM PRIMING DENATURAZIONE APPAIAMENTO (aspecifico) DI ESANUCLEOTIDI xpx xpx xpx xpx xpx xpx xpx RIEMPIMENTO CON dntp α 32 P datp (P) Pol di Klenow Si possono ottenere sonde con un alta attività specifica, da 10 a 50 volte superiore a quelle ottenute con la Nick translation. Si possono marcare anche frammenti molto corti per i quali la nick translation non è molto efficace.

29 RANDOM PRIMING

30 MARCATURA NON RADIOATTIVA VANTAGGI: Eliminazione dei pericoli alla salute e all ambiente derivanti dai radioisotopi Possibilità di costruire sonde stabili Possibilità di utilizzarle in concentrazioni maggiori, così da incrementare la sensibilità senza causare problemi d innalzamento del segnale di fondo Possibilità di accorciare i tempi di analisi Ridurre i costi ecc

31 MARCATURA NON RADIOATTIVA La marcatura degli acidi nucleici non radioattiva o fredda avviene secondo due modalità: MARCATURA DIRETTA - I gruppi reporter sono legati direttamente al DNA. I gruppi reporter sono costituiti da droghe fluorescenti (Fluoresceina, Rodamina) o da enzimi marker chemiluminescenti (Fosfatasi alcalina, Perossidasi). MARCATURA INDIRETTA - I gruppi reporter sono legati indirettamente al DNA attraverso una interazione tra un gruppo di modificazione della sonda (ibridazione) e una molecola indicatrice universale che in maniera specifica riconosce e lega la sonda modificata. Quindi i sistemi indiretti richiedono innanzi tutto l alterazione della sonda mediante l introduzione di un particolare gruppo di modificazione. Gruppi di modificazione : Biotina (o Vitamina H) Digossigenina Fluoresceina Ecc.

32 Natura dei gruppi reporter: Fluorescenti. Vari fluorofori con emissioni di lunghezza d onda diversa (cioè di diversi colori) vengono incorporati nei nucleotidi o attaccati direttamente alle molecole di DNA (marcatura diretta) e, successivamente, rivelati con una pellicola adatta, con un microscopio a fluorescenza o con un rivelatore di fluorescenza. Chemiluminescenti. Il segnale non è generato direttamente dalla molecola, ma deve essere sviluppato mediante trattamento con composti chimici (es. marcatura con fosfatasi alcalina rivelata con diossietano per produrre chemiluminescenza)

33 MARCATURA CON DIGOSSIGENINA Si basa sull incorporazione nella catena di DNA, in fase di sintesi, di deossiuridina trifosfato il quale, mediante un braccio spaziatore, porta legata la digossigenina (Dig-dUTP).

34 La sonda così ottenuta viene utilizzata per tutti i tipi di ibridizzazione su filtro e viene rivelata immunologicamente utilizzando un anticorpo monoclonale anti-digossigenina coniugato con la fosfatasi alcalina. Si forma così un complesso aptene-anticorpo che può essere evidenziato aggiungendo un adatto substrato della fosfatasi alcalina (X fosfato) e il colorante nitroblutetrazolio (NBT).

35 (sonda)

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37 MARCATURA CON BIOTINA La reazione consiste nell incorporazione nel DNA di nucleotidi biotinilati. I nucleotidi biotinilati vengono inseriti all interno di una molecola di DNA attraverso marcature interne o alle estremità. Dopo aver utilizzato la sonda in esperimenti di ibridazione, il filtro viene fatto reagire con avidina o streptavidina. Queste a loro volta sono legate a particolari molecole indicatrici quali fluorocromi o particolari enzimi (fosfatasi, perossidasi). Fornendo i substrati per questi enzimi si ottiene lo sviluppo di una reazione colorata.

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