Tecniche di microscopia

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1 Tecniche di microscopia I microscopi permettono di vedere l estremamente piccolo I microscopi ottici utilizzano lenti di vetro in grado di deflettere e focalizzare i raggi luminosi per riprodurre le immagini ingrandite La luce è rifratta (curvata) quando passa da un mezzo ad un altro 1

2 L indice di rifrazione misura di quanto una sostanza ritarda la velocità della luce La direzione e l ampiezza di tale deviazione sono determinate dagli indici di rifrazione dei due mezzi che formano l interfaccia Il prisma devia la luce perché il suo indice di rifrazione è da quello dell aria e la superficie è colpita dalla luce con un certo angolo Le lenti funzionano come sistemi di prismi 2

3 I raggi luminosi si concentrano in un punto specifico, detto punto focale La distanza tra centro della lente e punto focale è la distanza focale La forza della lente è correlata alla distanza focale: Distanza focale breve maggiore ingrandimento Il microscopio ottico Microscopio in campo chiaro Microscopio in campo oscuro Microscopio a contrasto di fase Microscopio a fluorescenza Microscopi composti L immagine è formata mediante 2 lenti 3

4 Il Microscopio in campo chiaro Produce un immagine scura su un fondo più brillante Formato da diverse lenti obiettivo I microscopi parafocali mantengono il fuoco quando gli obiettivi vengono cambiati Ingrandimento totale ingrandimento delle lenti oculari moltiplicato per quello delle lenti obiettivo 4

5 5

6 L ingrandimento totale si ottiene moltiplicando l ingrandimento dell obiettivo per quello dell oculare Obiettivo 45X e oculare 10X danno un ingrandimento di 450 volte 6

7 Risoluzione del Microscopio Capacità di una lente di separare e, quindi, distinguere piccoli oggetti molto vicini fra loro La lunghezza d onda della luce utilizzata è il principale fattore di risoluzione Equazione di Abbé determina la distanza minima tra 2 oggetti che si possono considerare entità separate d = 0.5λ / n sin θ Lunghezza d onda minore risoluzione maggiore 7

8 Ricordiamo che il potere di risoluzione dipende dal mezzo in cui la lente opera Per avere un > potere di risoluzione si deve l indice di rifrazione usando l olio da immersione 8

9 Microscopio in campo oscuro Un cono di luce è focalizzato sul campione per impedire ai raggi non riflessi e non rifratti di penetrare nell obiettivo L immagine è formata dalla luce riflessa o rifratta dal campione 9

10 Produce un immagine brillante dell oggetto su un fondo scuro Si usa per osservare preparati vivi, non colorati Negli eucarioti, usato per osservare le strutture interne degli eucarioti Nei procarioti, usato per identificare batteri come il Treponema pallidum 10

11 Microscopio a contrasto di fase In seguito alla scarsa Δ di contrasto tra cellule ed H 2 O le cellule non pigmentate si distinguono male in campo chiaro aumenta il contrasto tra le strutture intracellulari che hanno solo piccole Δ nell indice di rifrazione le quali sono trasformate in variazioni dell intensità luminosa metodo eccellente per l osservazione di cellule viventi Particolarmente utile per la rivelazione di componenti batteriche come le endospore o i corpi d inclusione che hanno indice di rifrazione diverso da quello dell acqua 11

12 Microscopio a fluorescenza Mostra un immagine brillante dell oggetto derivata dalla luce fluorescente emessa dal campione Quando assorbono energia alcune molecole sono eccitate e rilasciano tale energia accumulata sotto forma di luce con λ >, tornando ad un livello energetico più stabile In microscopia a fluorescenza il campione è esposto a luce UV, violetta o blu i campioni vengono generalmente colorati con fluorocromi Applicazioni in studi di microbiologia medica e di ecologia microbica 12

13 13

14 Preparazione e colorazione dei campioni In seguito alla scarsa Δ di contrasto tra cellule ed H 2 O, spesso i microrganismi devono essere fissati e colorati prima di effettuare l analisi microscopica la visibilità del campione ( il contrasto) accentua le caratteristiche morfologiche specifiche (crea variazioni di colore tra strutture cellulari) permette di conservare i campioni 14

15 Fissazione conserva le strutture interne ed esterne e le fissa nella loro posizione tale processo inattiva gli enzimi che distruggono la struttura e la rafforza in modo che non si alteri nel tempo gli organismi sono generalmente uccisi e adesi fortemente al vetrino Fissazione con calore di routine con i procarioti conserva la morfologia complessiva ma non le strutture interne Fissazione chimica per gli organismi più grandi e più delicati protegge la substruttura e la morfologia cellulare I fissativi reagiscono con le componenti cellulari, quali lipidi e proteine, rendendole inattive, insolubili ed immobili 15

16 Coloranti e colorazioni semplici I coloranti dei microrganismi rendono le strutture interne ed esterne della cellula più visibili aumentando il contrasto con lo sfondo Essi possiedono 2 caratteristiche comuni: 1. I gruppi cromofori, gruppi chimici con doppi legami coniugati che conferiscono colore alla sostanza 2. Capacità di legarsi alle cellule con legami ionici, covalenti o idrofobici I coloranti ionizzabili possiedono gruppi carichi: Basici sono dei cationi Acidi sono degli anioni 16

17 colorazione semplice si usa un solo colorante metodo semplice e rapido si possono determinare dimensione, forma e organizzazione dei batteri (coloranti basici) 17

18 colorazione differenziale Si possono distinguere i microrganismi in gruppi La colorazione di Gram permette di dividere i batteri in 2 classi: - Gram positivi (+) - Gram negativi (-) 18

19 Colorazione di Gram 19

20 Colorazione acid-fast particolarmente utile per colorare i membri del genere Mycobacterium es., Mycobacterium tuberculosis es., Mycobacterium leprae l alto contenuto lipidico della parete è caratteristiche di colorazione responsabile delle 20

21 21

22 Colorazione di strutture specifiche colorazione negativa colorazione della capsula usata per visualizzare la capsula che circonda il batterio i batteri risaltano incolori e luminosi su uno sfondo scuro 22

23 colorazione delle endospore tecnica di doppia colorazione l endospora batterica è di un colore mentre la cellula vegetativa di un altro colorazione dei flagelli viene applicato un mordensante per aumentare lo spessore dei flagelli 23

24 Microscopia elettronica Raggi di elettroni sono usati per produrre immagini La lunghezza d onda del raggio di elettroni è molto più corta di quella della luce, ne risulta una risoluzione molto più alta 24

25 25

26 Microscopio elettronico a scansione Microscopia confocale 26

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