Kit didattico Edvotek: la Tecnica del DNA fingerprinting

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1 International pbi S.p.A. Milano Copyright pbi MARZO 2003 Kit didattico Edvotek: la Tecnica del DNA fingerprinting Introduzione L analisi del profilo di restrizione del DNA, detto anche DNA fingerprinting, è un metodo sviluppato da pochi anni che permette l identificazione del DNA da campioni sconosciuti. Questo metodo è diventato realmente importante in campo forense dove è utilizzato in caso di delitto e per la determinazione di paternità. Al contrario di altri metodi convenzionali, il DNA fingreprinting consente una identificazione con grande accuratezza. Il DNA fingerprinting prevede la corsa elettroforetica di frammenti di DNA generati da enzimi di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi, sono capaci cioè di rompere il legame fosfato delle due catene di DNA. I punti di taglio corrispondono a sequenze specifiche, chiamati siti di taglio che sono lunghi da 4 a 8 paia di basi. La grandezza dei frammenti generati dipende dalla distanza tra i siti di taglio. In generale, più è lunga la molecola di DNA e più alta è la probabilità che ci sia un sito di restrizione. Un cromosoma umano, lungo 100 milioni di paia di basi, se trattato con un enzima che riconosce siti di 6 paia di basi, viene tagliato in circa frammenti di lunghezza diversa che vanno a definire il fingerprinting specifico. Nessun individuo ha esattamente lo stesso pattern di restrizione di un altro: queso è dovuto alla variabilità dei geni. Un gene è presente nella popolazione in forme diverse dette alleli, e nella popolazione esiste un grandissimo numero di alleli che variano la sequenza del genoma; questi hanno sequenze diverse tra loro, quindi i siti di restrizione sono distribuiti diversamente lungo la sequenza. Ne consegue che un enzima taglierà in posizioni diverse da allele ad allele, dando frammenti di diversa lunghezza che produrranno profili di fingerprinting diversi su gel di agarosio. Il kit DNA fingerprinting cod. n Obiettivo di questo esperimento è sviluppare una conoscenza di base della tecnica del DNA fingerprinting. Gli studenti analizzeranno le variazioni nei pattern creati dagli enzimi di restrizione da diverse molecole di DNA, per identificare il colpevole di un crimine usando la logica del DNA fingerprinting. Il DNA di due sospetti è stato tagliato con due diversi enzimi di restrizione in condizioni separate: l obbiettivo è confrontare i pattern di frammentazione su gel di elettroforesi e detreminare chi tra il sospetto 1 e 2 era sulla scena del crimine.

2 Nota Applicativa n 856 Pag. 2 Come utilizzare il kit DNA fingerprinting Il kit DNA fingerprinting cod. n è composto da: A campione di DNA dalla scena del delitto tagliato con l enzima 1 A campione di DNA dalla scena del delitto tagliato con l enzima 2 A campione di DNA dal sospetto 1 tagliato con l enzima 1 A campione di DNA dal sospetto 1 tagliato con l enzima 2 A campione di DNA dal sospetto 1 tagliato con l enzima 1 A campione di DNA dal sospetto 1 tagliato con l enzima 2 Gel loading solution di pratica Polvere di Agaosio Buffer per elettroforesi 50x Pellicole DNA Blue InstaStain Blu di Metilene concentrato Pipetta da 1 ml Cilindro da 100 ml (e confezione dei campioni) Micropipette monouso Guanti e occhiali protettivi dovrebbero essere indossati secondo buona prassi di laoratorio. Preparazione del gel Chiudere i lati aperti del vassoio porta-gel usando le pareti in gomma o con nastro adesivo. 1. usando le pareti in gomma: posizionare una parete in gomma per ogni lato del pozzetto Assicurarsi che le pareti in gomma siano bene in contatto con i bordi del vassoio 2. usando il nastro adesivo distendere il nastro adesivo sul bordo mancante del vassoio, facendolo aderire alle pareti laterali ed a quella inferiore Premere sui punti di contatto per assicurare una buona aderenza Posizionare il pettine nelle scanalature più vicine al bordo del pozzetto. Assicurarsi che il pettine sia ben posizionato. L esperimento richiede un gel allo 0.8% di agarosio Tabella A : quantità richieste per un gel allo 0.8% di agarosio Misura del Q.tà di agarosio Q.tà di buffer Q.tà di acqua Volume gel (50x) distillata totale 7x7 0.24g 0.6ml 29.4ml 30ml 7x g 1.2ml 58.8ml 60ml 10.5x14 0.8g 2.0ml 98.0ml 10ml Usare una beuta da 250 ml per preparare il tampone: con una pipetta da 1 ml, misurare il buffer 50x e aggiungere acqua distillata come indicato nella Tabella A. Aggiungere la quantità richiesta di agarosio, mescolare.

3 Nota Applicativa n 856 Pag. 3 Indicare con un pennarello il livello di volume sull esterno della beuta. a circa 55 C fino a dissolvere la polvere di agarosio. La soluzione dovrà essere trasparente e priva di particelle solide. 1. con forno a microonde Coprire l imboccatura della beuta per ridurre l evaporazione per 1 minuto circa Agitare la sospensione e riscaldare con intervalli di 25 secondi fino alla totale dissoluzione dell agarosio CoPreparazione me preparare del il g Gel di di el Elettroforesi Caricare i campioni in pozzetti consecutivi Versare l agarosio nel vassoio Rimuovere i blocchi alle estremità ed immergere il gel nella vaschetta elettroforetica Campioni di gel pronti Chiudere il coperchio, connettere le prese all alimentatore ed iniziare la corsa 2. con piastra riscaldante Coprire l imboccatura della beuta per ridurre l evaporazione fino all ebollizione, agitando di tanto in tanto. Scaldare finchè l agarosio è completamente dissolto Decolorare e visualizzare i risultati su gel Rimuovere il gel e colorare con la pellicola InstaStain Raffreddare la soluzione di agarosio sino a 55 C, agitando dolcemente per dissipare il calore. Se c è stata una evaporazione consistente, aggiungere acqua distillata per riportare la soluzione al volume originale, quello marcato con pennarello prima del riscaldamento. Posizionare il vassoio su una superficie piana Assicurarsi che i lati del vassoio siano chiusi ermeticamente (con il nastro adesivo o con le pareti in gomma) Versare la soluzione di agarosio nel vassoio. Lasciare solidificare completamente il gel per 20 minuti

4 Nota Applicativa n 856 Pag. 4 Quando il gel è completamente solidificato, rimuovere con attenzione il nastro adesivo o le pareti in gomma. Rimuovere il pettine estraendolo delicatamentre verso l alto. Mettere il vassoio col gel nella camera elettroforetica orientato in maniera corretta, con i pozzetti in prossimità del polo negativo (cavo nero). Riempire la camera elettroforetica con il volume necessario di buffer diluito. Assicurarsi che il gel sia completamente coperto dal gel. Il gel di agarosio è comunemente chiamato submarine gel perché sommerso dal tampone per il caricamento dei campioni e la corsa. Caricamento dei campioni e corsa elettroforetica Scaldare a 65 C un beaker pieno d acqua per riscaldare le microprovette contenenti frammenti di DNA. A questa temperatura i frammenti generati dagli enzimi di restrizione sono completamente separati, quindi questo passaggio è indispensabile per una buona separazione delle bande nel gel. Aspettare che i campioni si raffreddino leggermente e caricare i campioni A-F consecutivamente nel gel. La quantità di campione da caricare è circa ul. Caricamento del gel Dopo aver caricato i campioni, mettere delicatamente il coperchio sulla vaschetta, collegando gli elettrodi in posizione corretta. Inserire lo spinotto rosso della camera nella presa rossa dell alimentatore e lo spinotto nero nella presa nera dell alimentatore. Settare l alimentatore al voltaggio richiesto (70 Volts) e far partire l elettroforesi per il tempo indicato nella tabella B. Non muovere la vaschetta dopo il caricamento dei campioni o durante la corsa. Tabella A : voltaggi e tempi di corsa Volts Tempo min. richiesto Tempo di corsa ottimale min 2.0 h min 4.5 h min 45 min Controllare che l alimentatore raggiunga il voltaggio voluto e verificare la formazione di bolle sugli elettrodi della camera. Lasciar correre il colorante blu per almeno 4 cm dal pozzetto per avere una separazione adeguata delle bande di DNA. Al completamento dell elettroforesi, spegnere l alimentatore, togliere le spine del gel e rimuovere il coperchio della camera. Rimuovere il vassoio contenente il gel, mettendo le mani su entrambe le estremità e facendo attenzione che il gel non esca dal vassoio. Togliere il gel dal vassoio e procedere con la colorazione.

5 Nota Applicativa n 856 Pag. 5 Per un corretto utilizzo della vaschetta da elettroforesi: La temperatura della soluzione di agarosio versata nel vassoio non deve mai superare i 55 C: una soluzione più calda può deteriorare irrimediabilmente il vassoio. Non toccare mai gli elettrodi di platino. La corrente elettrica deve sempre essere spenta, e le spine disconnesse dall alimentatore quando il coperchio è staccato dall apparato. Colorazione del gel Quando l elettroforesi è completata, porre il gel su una superficie piana. Inumidire il gel con alcune goccie del tampone di corsa. Dopo aver indossato i guanti, mettere il lato blu della pellicola DNA Blue Instatain sul gel inumidito. Con fermezza, muovere più volte le dita lungo la superficie del foglio InstaStain. Mettere il gel con la pellicola InstaStain su un foglio di plastica, quindi mettervi sopra il vassoio portagel ed un beaker vuoto al centro. Questo consentirà alla pellicola InstaStain di mantenere un buon contatto con la superficie del gel. Lasciare InstaStain a contatto col gel per 15 minuti. Dopo 15 minuti rimuovere la pellicola InstaStain e trasferire il gel in una larga vaschetta di plastica. Effettuare decolorazione con acqua distillata alla temperatura di 37 C. La decolorazione va effettuata per tre volte con acqua distillata a 37 C, cambiando acqua ogni 10 minuti, ed agitando di tanto in tanto la vaschetta. Dopo la prima decolorazione, le bande più grosse di DNA saranno visibili in blu scuro in contrasto con l azzurro del gel. Quando il gel è completamente decolorato, la banda blu scuro diverrà più visibile, mentre lo sfondo si colorerà di un azzurro chiaro ed uniforme. Rimuovere con cautela il gel per esaminarlo. Se il gel non è visibile e le bande sono difficili da esaminare, ripetere la procedura di decolorazione. Colorazione del gel Un gel colorato con DNA Blu Instastain può essere conservato in frigorifero per alcune settimane in una busta di plastica con alcune goccie di tampone decolorante. NON CONGELARE I GEL DI AGAROSIO. I gel possono essere gettati come rifiuto solido.