CEQ ISS IX turno 2013

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1 Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare Schema: Sindrome dell X-Fragile (gene FMR) CEQ ISS IX turno Valutatori: Dott.ssa Marina Grasso Dott.ssa Anna Ravani Dott.ssa Silvia Russo Roma ISS marzo

2 Campione Campione Campione Campione

3 Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare Schema: Sindrome dell X-Fragile (gene FMR) Schema Completo Schema Pre-screening

4 Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare Schema: Sindrome dell X-Fragile (gene FMR) punteggio CEQ ISS IX turno Schema Completo: laboratori Schema Prescreening: laboratori Laboratori Risposto correttamente Errata Genotipizzazione ( campione) New New Poor performance

5 Campione Commento: Le analisi molecolari hanno permesso di stabilire che Ellicine Valerio presenta un genotipo a mosaico allele normale/mutazione completa al locus FMR, condizione compatibile con l indicazione all indagine.

6 Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare Schema: Sindrome dell X-Fragile (gene FMR) VIII Turno () Punteggi dei laboratori partecipanti Schema unico IX Turno () Punteggi dei laboratori partecipanti Schemi : Completo e Prescreening / / non partecipato Blu: Lab. Schema completo Azzurro: Lab. Schema Pre-scerening Rosso : Poor Performance

7 Genotipizzazione - Pettorbi Genotipizzazione media genotip. su max :. poor VIII Turno IX Turno Punteggio Insuff. / lab (+ n.v. su genotipiz.) Performance insufficiente / lab ( su genotipizz.) Media punteggio Genotip.: Media punteggio Genotip.:. su. su Genotipizzazione - Aberuste media genotip. su max :. poor Genotipizzazione - Tappenti media genotip. su max :. poor media genotip. su max :. poor il metodo usato deve essere esplicitato chiaramente indicando bibliogr. (Zhou et al., J Med Genet ) Marcatore: meglio usare bp ladder Genotipizzazione - Ellicine No dato grezzo SB (problemi archiviazione) Solo MS-PCR : MS-PCR e separazione frammenti con elettroforesi su gel di agarosio. Lab. Schema completo:

8 Genotipizzazione - Pettorbi Genotipizzazione media genotip. su max :. poor VIII Turno IX Turno Performance insufficiente / lab (più n.v. su genotipiz.) Performance insufficiente / lab ( su genotipizz.) Media punteggio Genotip.: Media punteggio Genotip.:. su. su Genotipizzazione - Aberuste media genotip. su max :. poor Genotipizzazione - Tappenti media genotip. su max :. poor Genotipizzazione - Ellicine media genotip. su max :. poor -Pettorbi e -Tappenti L indagine per long-pcr ha evidenziato uno smear nel range di normalità, attribuibile ad alleli compresi tra le +/- e le +/- ripetute CGG. Lab. Schema completo: All indagine per Southern Blot, si evidenzia uno smear >. Kb con caratteristiche di mutazione piena, sia per quanto riguarda le dimensioni della regione di ripetute (superiore al normale) sia per quanto riguarda la metilazione delle isole CpG al del gene FMR (allele metilato).

9 Lab. Schema completo: Long-PCR (Enhanced Polymeras Chain Reaction Assay secondo Tassone F. et al., JMD ) e separazione dei frammenti su sequenziatore ABI Prism Southern Blot (digestione DNA genomico con enzimi di restrizione EcoRI/EagI e ibridizzazine con sonda StB.) Campione smear nel range di normalità, attribuibile ad alleli compresi tra le +/- e le +/- ripetute CGG. Campione

10 Interpretazione - Pettorbi Interpretazione media interpret. su max :. poor non valutati Interpretazione - Aberuste VIII Turno IX Turno Performance insufficiente su interpretaz. ( interpr. non valutate) Performance insufficiente su interpretaz. ( interpr. non valutata) Media punteggio Media punteggio Interpret.:. su Interpret.:. su media interpret. su max :. poor non valutati Interpretazione - Tappenti Lab. Prescreening: media interpret. su max :. poor non valutati Analisi molecolare eseguita su soggetto con ritardo mentale. L analisi ha evidenziato la presenza di un allele di (+/-) ripetizioni CGG. Il risultato consente di escludere che il ritardo mentale sia associato a sindrome dell X Fragile. Interpretazione - Ellicine media interpret. su max :. poor non valutato Metodo: analisi eseguita tramite FRAXA KitFL Experteam. Efficienza diagnostica: il sistema utilizzato non identifica espansioni superiori a triplette CGG, mosaicismi, mutazioni puntiformi/delezioni e non valuta lo stato di metilazione del promotore FMR Interpretazione risultato Mosaici Norm /Full ( % dei pz con s. X Fragile)

11 Referazione - Pettorbi Refertazione media refertaz. su max :. non valutati VIII Turno IX Turno Non valutate Non valutata Media punteggio Media punteggio Refertaz.:. Refertazione - Aberuste su Refertaz.:. su Lab. Schema completo: media refertaz. su max :. non valutati Refertazione - Tappenti media refertaz. su max :. non valutati Refertazione - Ellicine media refertaz. su max :. non valutato RISULTATO: l analisi molecolare, ha evidenziato la presenza di un allele espanso maggiore di ripetizioni CGG. CONCLUSIONI: Il risultato depone per una diagnosi di portatore della mutazione del gene FMR- responsabile della Sindrome dell'x Fragile. Si consiglia una consulenza genetica. mutazione completa : eventi mutazionali: - espansione > CGG - metilazione promotore gene FMR N.B. > CGG ma promotore NON metilato >>> High Functioning males SB (no dati grezzi) / MS-PCR > CGG È necessario riportare lo stato di metilazione del promotore FMR per definire se il genotipo si associa alla s. X Fragile

12 Carenze riscontrate ancora frequentemente Dati grezzi di qualità non ottimale ( laboratori) sensibilità e specificità analitica non riportate ( laboratori) Sensibilità diagnostica non riportata ( laboratori) Raccomandazioni sul Referto: Occorre esplicitare l indicazione clinica all indagine Si consiglia inserire i numeri di pagina anche quando il referto è redatto in una pagina (/) Nell anonimizzazione del referto per la partecipazione al CEQ, si consiglia di lasciare le voci riguardanti l intestazione per farne capire la struttura. Le categorie alleliche sono: il limite di accuratezza delle triplette varia a seconda della categoria allelica Normale < CGG (±) < CGG Intermedio - CGG (±) - CGG Premutazione - GG (±) tra - Mutazione completa > CGG (±) tra - CGG

13 Terminologia I risultati ottenuti sono compatibili con un maschio selvatico (sano) al locus FMR- ; Ellicine Valerio Pettorbi Mario Tappenti Giulio anche il termine Sano è poco appropriato, in questo caso sarebbe opportuno indicare: "genotipo maschile con un numero di triplette CGG nel range della normalità" L indicazione all estensione dell analisi ai genitori è inappropriata; il paziente è maschio e la sindrome è legata all'x è sufficiente indicare l analisi alla madre (,) Linguaggio inadeguato: Aberuste Maria Non si può parlare di "femmina emizigote", ma di "femmina eterozigote" per la premutazione (,)

14 Note : Contaminazione in reazioni PCR : deve essere esclusa inserendo gli opportuni controlli negativi (Bianco) Contaminazione Materna in Diagnosi Prenatale : deve essere SEMPRE esclusa con opportuna analisi di microsatelliti. Rare varianti genetiche : scelta accurata di coppie di primers può scongiurare l allele drop out Erronee identificazioni di paternità : argomento da trattare in sede di colloquio per la raccolta del consenso informato Scambi di campioni : deve essere escluso assicurando tracciabilità del campione mediante per es. Codice a Barre; identificazione paziente con ameno elementi (Cognome-Nome e codice laboratorio-id) buona pratica: per es. confermare una mutazione mediante ripetizione dell analisi a partire dal campione originale (sangue periferico. ecc ) Si ritiene, pertanto, non opportuno inserire questa nota nel referto. E' Importante indicare invece : Sensibilità diagnostica probabilità che un Test genetico sia Positivo in un soggetto affetto/portatore. (detection rate) (permette di valutare i «falsi negativi») Specificità diagnostica del test : probabilità che un Test genetico sia Negativo in un soggetto normale. (permette di valutare i «falsi positivi»)

15 ACCURATEZZA del Sizing Distribuzione del n. CGG riportati su referto allele Premutato di Aberuste allele normale di Aberuste Lab Lab Long PCR PCR convenz. Agaroso ABI Lab TP-PCR allele normale di Ellicine Metodi Southern blot Amplidex TM FMR PCR Kit, asuragen (TP PCR) PCR convenzionale (Fu et al ) Amplidex TM FMR mpcr Kit, asuragen (mpcr) MLPA ME-B, MRC Holland FRAXA PCR kit, Experteam Lab Lab Long PCR PCR convenz. Agaroso ABI Methyl sensitive PCR Long PCR N. di Lab

16 Long PCR Elettroforesi Agarosio Southern blot

17 TP-PCR bp, = bp,:=, >> CGG bp, = bp,:=, >> CGG Usare Macro introducendo Fattore di correzione e Fattore Mobilità (settato su strumento)

18 CGG X bp,,,,,, Y bp y=mx + C y =,x +, R² =, m= fattore di mobilità C = fattore di correzione m e C vanno inseriti nella macro CGG Repeats

19 Obbiettivo >> Accuratezza e Standardizzazione del sizing CGG

20 RINGRAZIAMENTI Anna Ravani Silvia Russo - Laboratorio di Genetica Molecolare, U.O. Genetica Medica, AO Universitaria Ferrara Laboratorio Genetica Istituto Auxologico Italiano - Cusano Milanino, Milano Federica Censi Fabrizio Tosto Giovanna Floridia Domenica Taruscio Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare