Tecniche di microscopia ad alta risoluzione: vedere le molecole al microscopio, studiare il loro comportamento

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1 Perché fare microscopia? Tecniche di microscopia ad alta risoluzione: vedere le molecole al microscopio, studiare il loro comportamento A volte è meglio osservare gli individui che fare misure mediate di un singolo osservabile (approccio delle singole molecole). La statistica collega la distribuzione dei parametri dei singoli individui con i risultati dei metodi convenzionali che operano su grandi popolazioni. Lo studio delle singole molecole, che bisogno c è? studi dinamici Le molecole possono fare cose complicate, o inattese. Se una popolazione è sincronizzata, una tecnica di studio di popolazione può caratterizzarle Le tecniche microscopiche permettono di vedere i campioni o comunque di studiare loro caratteristiche localizzate nello spazio (composizione, interazioni) La scelta tra le varie tecniche a disposizione dello sperimentatore può essere fatta sulla base delle dimensioni degli oggetti da osservare, ma anche sulla loro composizione, sulle condizioni di osservazione e sul tipo di osservabile che interessa. nanoscopia ottica Ma se le molecole fanno cose complicate e non sono sincronizzate, o diverse molecole fanno cose diverse è meglio caratterizzarle una alla volta.

2 LE MICROSCOPIE A SONDA Scanning Probe Microscopies (SPM) Una nuova classe di tecniche di microscopia per l analisi delle superfici e degli oggetti su esse deposti Sono basate su di una sonda microscopica posta in prossimità del campione: è il tramite tra noi ed il nano-mondo. Non sono coinvolte lunghezze d onda o lenti di alcun tipo. Sono profilografi ad altissima risoluzione e molto più. Funzionano secondo un principio simile al fonografo di Edison. Sono nate negli anni 80: nel 1982 la microscopia ad effetto tunnel nel 1986 la microscopia a forza atomica Nel 1986 Gerd Binnig e Heinrich Rohrer hanno ricevuto il premio Nobel in Fisica per l invenzione del microscopio a tunnel; nello stesso anno Ernst Ruska ha ricevuto il premio Nobel per l invenzione del microscopio elettronico. Sono nate anche grazie alla nuova possibilità di muovere oggetti nello spazio con precisione dell ordine dell Ångström con l ausilio dei piezoelettrici. Danno informazioni tridimensionali di topografia di una superficie e possono lavorare in ogni tipo di condizione. Il microscopio a sonda ed il campione I microscopi a sonda sono strumenti per l analisi di superficie. Sono progettati per studiare l interazione localizzata tra una sonda solida microscopica ed una regione piccola di una superficie (e degli oggetti su essa deposti) Mediante una scansione di tipo raster della sonda rispetto al campione (realizzata grazie alla tecnologia dei piezoelettrici) l interazione locale è misurata su una griglia di punti della superficie, fino ad ottenere una mappa, ovvero un immagine della superficie e degli oggetti deposti. L intensità dell interazione scelta è spesso dipendente dalla distanza tra la sonda ed il campione, per cui il microscopio riesce a studiare la topografia della superficie, ma molte sono le misurazioni possibili. scansione di tipo raster Immagini presentate con una scala di pseudo-colore ad interazione costante I modi operativi in SPM Le varie tecniche della famiglia delle microscopie a sonda (SPM) si differenziano per il tipo di interazione sonda-campione che possono misurare (e quindi per il tipo di sonda) Il capostipite della famiglia è il microscopio a scansione ad effetto tunnel, nato nel Il suo funzionamento si basa sul fatto che tra una sonda conduttrice ed una superficie anch essa conduttrice posti ad una certa differenza di potenziale può passare una corrente elettrica misurabile anche se i due conduttori non sono a contatto, ma sono molto vicini. L intensità della corrente dipende esponenzialmente dalla distanza tra i conduttori. Il segnale dipende dalla topografia del campione e dalla sua composizione ad altezza costante [film/animazione]

3 Nome Sonda Segnale Risoluzione Campioni Ambiente Applicazioni STM Punta conduttrice Corrente di tunneling SFM=AFM NSOM SICM (ion conductance) SECM (electrochemical) STPM (thermal probe) Cantilever flessibile Guida d onda sottile Micropipetta Microelettrodi Alcuni tipi di microscopie a sonda Microtermocoppia 1-2 Å Conduttori e semiconduttori fluidi Forza 1-2 Å Superfici solide Fluidi (varie) Flusso di fotoni Flusso di ioni Corrente faradica Flusso termico Å Superfici Fluidi (varie) ~200 Å Superfici Soluzione elettrolitica ~1000 Å Superfici Soluzione elettrolitica Analisi di superficie, elettrochimica Membrane ~1000 Å Superfici Aria, fluidi (varie) Elettrochimica UN CONFRONTO CON ALTRE TECNICHE Microscopio Microscopio SPM Ottico Elettronico Ambiente del campione qualsiasi vuoto qualsiasi Profondità di campo bassa grande (SEM) media Profondità di fuoco media bassa bassa Risoluzione x,y 0.2 µm 5 nm (SEM) nm ~0.1 nm (HRTEM) Risoluzione z - (TEM) 0.01 nm Ingrandimenti 1 X - 2x10 3 X 10 X X 5x10 2 X X Preparazione del campione poca freeze drying, nessuna coating, etc. Caratteristiche del campione non totalmente resistente al non avere grosse trasparente vuoto e non deve variazioni in accumulare carica; altezza sottile (TEM) Ingombro/locali dedicati basso/no alto/si basso/no Analisi di superficie si si (SEM) si Analisi in profondità si si (TEM) si (NSOM) Danni a camp. Fragili no si (tranne cryo) limitata Tempo di scala veloce veloce lento Possibilità studi dinamici si no si La più forte limitazione dell STM è quella di dover osservare campioni conduttori o semiconduttori, per cui ha un uso molto limitato per i campioni biologici (generalmente non conduttori). Moving Atoms by STM (using van der Waals Force) Ha una risoluzione orizzontale e verticale altissima, tale che può osservare gli atomi. Variando le correnti in gioco, la sonda dell STM può anche manipolare i singoli atomi. Read Move Read Lega Pt/Rh: Rh chiaro, Pt scuro I Omino di CO su Pt D. M. Eigler and E. K. Schweizer, Nature 344, 524 (1990).

4 Un esempio di immagine di campioni biologici all STM Teste di fago T4 Il microscopio a scansione in campo prossimo (NSOM): luce oltre il limite della diffrazione STM TEM 500 nm 200 nm Schema di un NSOM commerciale Il tipo di tecnica SPM più diffuso oggi è la microscopia a forza atomica (AFM o SFM) Un neurone dell ippocampo Una sonda solida microscopica è posta a contatto con la superficie del campione. La sonda è integrata su di una leva molto flessibile, che si flette quando la sonda nel suo moto incontra parti più alte o più basse del campione. Attraverso la deflessione della leva, lo strumento registra la forza di interazione tra la sonda ed il campione. A: immagine della topografia (fibra NSOM come sonda AFM) B: immagine di fluorescenza dovuta ad un indicatore della presenza di Ca 2+ È necessario un rivelatore della deflessione della leva, oltre ad un sistema per muovere la sonda rispetto al campione

5 laser beam photodiode Schema di un AFM Come si presenta un AFM commerciale? specimen Piezoelectric scanner cantilever probe (tip) Il funzionamento in contact-mode apparato per osservazioni in fluido [film/animazione] Cantilevers e sonde per SFM Più affilata è la sonda, migliore è la risoluzione Deformazione delle dimensioni dovuta alla dimensione finita delle sonde La risoluzione delle immagini dipende sia dalla geometria della sonda che da quella del campione 4(Rc Rm) Rm(Rc Rm) W Rc Leva (cantilever) e sonda integrata per AFM a vari ingrandimenti (foto SEM) Diametro apparente di un oggetto circolare di raggio Rm osservato con una Punta parabolica con raggio di curvatura Rc (se Rc>Rm)

6 AFM image simulation of DNA La tecnologia delle sonde: la sonda è la parte più importante, quella che determina l interazione locale, cioè quello che si misura -più è sottile, maggiore è la risoluzione! nanotubi come sonde SFM sonde SFM affilate con un fascio di elettroni Alcune immagini tipo di microscopia AFM Tecniche SFM in corrente alternata: il tapping-mode In tapping-mode il sistema di retroazione mantiene costante l ampiezza di oscillazione del cantilever, seguendo così la superficie del campione. Vantaggi: minore sensibilità alle vibrazioni esterne, miglior rapporto segnale/rumore, minore danno alle superfici soffici, maggiore stabilità di misura, anche con alta umidità. In ultra-alto vuoto, il corrispettivo è il non-contact, ove la sonda oscilla ad una distanza dalla superficie tale da risentire delle forze di van der Waals e produrre immagini a risoluzione atomica su campioni piatti. Tapping mode AFM Contact mode AFM 61 m 15 m 10 m scan scan

7 Una visualizzazione del tapping-mode Sonde opportunamente funzionalizzate possono mettere in gioco interazioni chimiche specifiche per un campione e fornire una risoluzione composizionale e dare informazioni sul comportamento del campione [film/animazione] sonde funzionalizzate per riconoscimento chimico Sonde opportune possono anche misurare la temperatura locale di un campione (ad esempio una parte di una cellula). Varie tipologie di movimento della sonda in scansione possono essere usate per misurare la compressibilità locale di un campione, o la presenza di campi elettrici o magnetici locali (tramite sonde opportunamente modificate) microscopia con modulazione della forza fibre di carbonio in una matrice epossidica microscopia SFM con misura dello sfasamento dell oscillazione Flusso di calore su un circuito integrato topografia e fase di una traccia magnetica (magnetic force microscopy con lift-mode)

8 È inoltre possibile creare strumenti ibridi composti da più tipi di microscopio che osservano un campione contemporaneamente con diverse tecniche Le applicazioni biologiche Il microscopio a forza (AFM o SFM) è il membro della famiglia SPM che meglio si adatta allo studio dei campioni biologici e delle macromolecole in particolare Può operare in qualsiasi mezzo (in liquido!) Può registrare immagini ad altissima risoluzione (nm o frazioni di nm) Può seguire l evoluzione temporale di un campione (processi biologici) Può studiare le forze di interazione tra le molecole BioScope = m. ottico + SFM Per lo studio delle macromolecole, queste sono deposte su substrati molto piatti, la cui topografia non intralci l osservazione del campione Ci sono molte tecniche diverse per l adsorbimento di campioni biologici sulle superfici. La necessità che i campioni siano legati ad una superficie è spesso vista come una limitazione, ma talvolta è un vantaggio. Esempi di applicazioni per le macromolecole: SFM di proteine (strati organizzati=altissima risoluzione) Immagini di purple membrane di Halobacterium salinarium (25 % lipidi, 75 % batteriorodopsina) SFM di proteine: le proteine isolate sono oggetti molto soffici e possono essere schiacciate dalla sonda. Per migliorare la qualità delle immagini possiamo utilizzare degli agenti reticolanti che le rendono più rigide, oppure congelarle. IgG a 84 K Immagini di hexagonally packed intermediate layer (HPI) di Deinococcus radiodurans

9 La microscopia SFM è una tecnica molto utilizzata per gli studi conformazionali degli acidi nucleici (anche nel nostro laboratorio) Campioni non colorati Osservati in uno stato idratato Risoluzione tridimensionale Risoluzione orizzontale EM Immagini di plasmidi deposti su mica ed osservati dopo blanda disidratazione È una delle migliori tecniche di studio microscopico per i complessi nucleo-proteici. 3 dimeri di CRO legati al DNA bending del DNA indotto dalla RNA polimerasi nel complesso di trascrizione Il fattore di trascrizione TFII promuove looping del DNA [film/animazione] Fibre di cromatina osservate con il microscopio SFM La possibilità di funzionare in fluido e di essere una tecnica non distruttiva permette all SFM di seguire processi macromolecolari mentre avvengono Visualizzazione della trascrizione del DNA immagini di microscopia elettronica di cromatina all interno del nucleo o digerita ed estratta dati di C. Bustamante e collaboratori

10 L adsorbimento su di una superficie è talvolta un problema, se forza su due dimensioni oggetti che vivono in tre. Negli studi dinamici, però, l adsorbimento rallenta i processi macromolecolari molto veloci, fino a renderli sufficientemente lenti da poter essere studiati con il microscopio a forza. Avvolgimento progressivo di una molecola di DNA a causa dell aumento della forza ionica Studio SFM della dinamica di plasmidi (dsdna) superavvolti Microchirurgia su scala sub-molecolare: la sonda SFM può interagire con i campioni e indurre delle transizioni conformazionali Visualizzazione della dinamica di molecole di DNA adsorbite Dinamica di molecole di pbr322 (4361 bp) e loro frammenti [film/animazione]

11 Risultati più recenti sullo studio AFM delle biomolecole: la visualizzazione diretta del passo dell elica del DNA. High-speed AFM, achieved first by T. Ando group (Kanazawa Univ., Japan) Thanks to some technological advancements: High-speed scanner Active dumping and counter balance can suppress mechanical vibration. Compact and reliable design Ultra small and soft cantilever with high resonance frequency Cantilever for HS-AFM can realize the observation of any soft samples such as a protein. Resonance frequency: 1500 khz (in air). Force constant: 0.1 N/m; Tip radius: < 10 nm High-speed and stable feedback control Clear and fine images of surface structures can be obtained by using the high-speed scanning. myosin AFM images of S. Ido et al., ACS Nano 2013 small cantilever AFM Image simulations by C. Rivetti IgG DNase Bal31 nuclease Interesting paper: Ando et al. Filming Biomolecular Processes by High-Speed Atomic Force Microscopy. Chemical Reviews (2014), 114, Uno degli sviluppi più interessanti è lo studio delle forze di interazione locale tra singole molecole. La curva di forza momento per momento Le curve di forza per misurare le forze di interazione tra sonda e campione [film/animazione]

12 Possibili impieghi delle curve di forza Studiare le forze di interazione tra punta e superficie per ottimizzare le condizioni di osservazione: - Minore danno possibile del campione - Minore artefatti sull immagine - Minore danno possibile alla punta - Controllo della risposta elastica del campione misurare le forze di interazioni tra sonda e superficie: - Per studiare adesione, forze di interazioni tra materiali, elasticità locale di superfici, misurare e applicare forze alle molecole (in analogia alle optical tweezers) o alle cellule: - Instaurando ponti molecolari tra sonda AFM e superficie Peak-force tapping-mode: fare immagini AFM composte di tante curve di forza Metodo: curve di forza sono registrate a 1-10 khz, mediante un elettronica molto veloce e muovendo la sonda con un onda sinusoidale e non triangolare (assenza di rimbalzi ). Vantaggi: - accurato controllo della forza verticale applicata (analogamente al contactmode) - forte riduzione delle forze laterali (analogamente al tapping-mode) - Maggiore tempo di vita delle sonde affilate - Possibilità di estrarre altre informazioni quantitative dalle curve di forza: caratterizzazione nanomeccanica (elasticità, adesione) in tempi rapidi. - Possibilità di calcolare immagini a forza zero. Peak-force tapping-mode: state of the art lateral resolution Si possono fare esperimenti di misura di forze di legame (tipo antigene-anticorpo) o esperimenti di stiramento di proteine (unfolding direzionale) che danno informazioni sui profili di energia potenziale dei legami che tengono insieme le strutture biologiche esperimenti di stiramento di molecole: studi di forze di legame e denaturazioni E rinaturazioni direzionali indotte

13 Alcuni esempi: Lo stiramento di una proteina modulare consente di studiare la forza che tiene insieme i domini e le cinetiche di folding e unfolding La misura della forza necessaria per le transizioni conformazionali e per i legami intermolecolari La transizione barca-sedia in un polisaccaride Lo svolgimento di una proteina costituita da domini a tandem (la titina) La separazione delle due catene del DNA a doppia elica (dati di S. Lindsay e collaboratori) Misura della forza di rottura del legame tra NTA Ni His-tag But what is Single-Molecule force spectroscopy? It is one of those techniques that seeks to measure the interaction forces between single molecules or that wants to study the behavior of molecules subjected to forces. Surprisingly, force is really a new concept in chemistry: it is common to speak about strong and weak bonds, implying that the more stable an interaction is, then the more force is needed to break it apart: the real story is more complicated. Usually, an interaction is characterized by its stabilization energy, while the rupture force often depends on how the force is applied (a very stable bond might break up at very low force). In most chemical processes, forces are not involved and everything happens isotropically. Some biological processes, instead, take place when a directional force is applied.

14 How to make a single-molecule pulling experiment for the AFM The basic procedure is the force curve (you know about that) Two surfaces are involved (probe and substrate): in fluid medium The molecule of interest is usually laid on the surface and picked up with the (functionalized) probe Usually, objects are probed by pulling and, optionally, releasing the pulling force measurable forces: stretching rupture How to make a single-molecule pulling experiment for the AFM A bond between the probe and the molecule is obtained via specific chemistry, or more simply by pushing the probe on one part of the adsorbed molecule and pulling the rest. It is important that very few interactions are established, to make sure that single molecular events are recorded: bonding takes place with Poisson statistics, reducing the probability of binding reduced the number of contemporary bonds so that most events are single interactions. In a properly performed experiment, only one in ten force curves contain a force information (if more, interpretation will be difficult, if less, experiment will be endless). This is usually accomplished by putting very few molecules on the probe and many on the surface. 3F F The preparation of the specimen and the probe is fundamental for the success of the experiment AND the interpretation of the results Anatomy of a single-molecule force curve A number of possible features are shown here: they are not commonly present at the same time. Sometimes they are not easy to recognize. Pulling is usually performed blindly, but not always The probe and the surface are repeatedly approached and retracted recording the force profiles, in search of a number of events to build up a statistics. It is not known where on a molecule one is pulling from. Pulls are made whether a molecular bridge is set or not (compare with optical tweezers). Thermal and instrumental noise is superimposed to all this. Forces are stochastically different amongst measurements. force In some cases it was possible to see better what is was being pulled: Andreas Engel imaged a layer of bacteriorhodopsin at high resolution, and then unfolded one entire multi-modular protein. Then the result was that the pulled protein was not in the layer any more. distance

15 Non-specific forces should be avoided (1/2) Especially when pushing into the specimen to settle a molecular bridge between the probe and the surface, strong non-specific interaction forces can arise. The non-specific forces: -are usually short ranged, but can be so strong to mask 100 nm of probe-surface separation, or more; - might be due to hard pushing (indenting) into the specimen, or by exposing a large portion of a (dull) probe to a surface, thus enabling a high number of weak interactions to settle; - are usually variable in time and area, prone to increase during the experiment due to fouling of the probe surface; Since they are strong and unpredictable, it is usually best to avoid non-specific interactions if possible by: careful choice of probe and substrate surface properties (if possible) gentle landing of the probe on the surface F non specific forces retract approach distance Non-specific forces should be avoided (2/2) An alternative that was used is trying to make short-range specific interactions overwhelming with respect to non-specific ones: using this type of approach it has been possible to estimate the force of molecular interactions, but the interpretation of data is not straightforward The best solution is setting a separation between the contact point and the interaction of interest by using a molecular linker. F s A linker is a spacer that forces the interaction of interest to go under tension when the probe is far from the surface (and non-specific forces are gone) If the linker is of a precisely known length, then it is also possible to use this extra piece of knowledge to recognize the interaction of interest among other ones that can possibly take place. F s A few words on substrates All the evaluations that are important for the choice of substrates for AFM are also good for force spectroscopy. - Surface topography is probably less important - Surface reactivity is probably more important (towards covalent or non-covalent adsorption, charging of surface, etc.) - Cleanliness is of top importance (not simple to recognize and avoid dirt) probably the most commonly used substrates for force spec. of proteins are gold and glass (mica or grafite to a lesser extent). Gold can take advantage of gold-thiol chemistry Glass can use silane chemistry Both need to be clean (also to be reactive) Glass: detergents, solvents, plasma, flame, Gold: piranha, aqua regia, plasma, cyclic voltammetry better if freshly evaporated (and annealed) or TSG Template Stripped Gold substrates (as of Hegner et al., Surface Science 1993) It is a method to fabricate flat gold substrates for microscopy or related applications - Gold is vacuum evaporated on the surface of freshly cleaved mica to make a flat layer; - The layer is then glued onto a glass cover slide with high performance epoxy glue. - When needed, the gold layer can be stripped off of the mica template and used (it is ultra-flat and ultra-clean) Epotek 733 glue TSG ultra-flat and clean surface Glass cover slide 200 nm of gold mica

16 How to establish a molecular bridge The easiest way is simply pushing on a molecule deposited on a surface. Used frequently for pulling modular proteins. It is understood that only the macromolecule section in between the attachment points gets pulled. Pros: very simple and general method Cons: unknown pulling location and direction; unknown damage to the specimen and to the underlying surface; possible multiple probe-molecule interactions with varying strength. Set bonds are of unknown nature, certainly favored by the huge pressure that can be exerted by the probe (for the plausible case of 1 nn force applied over 10 nm 2, a pressure of 1000 atm is exerted) An example of controlled covalent linkage via a PEG linker Hinterdorfer et al. Single Mol Alternatively, precious few molecules are covalently attached to the probe Dedicated chemistry has often been developed to establish specific interactions that do not require high force to be settled. This can be an occasion to introduce a molecular linker of known length and properties. Pulling modular proteins (tandem repeats of molecular events) Modular proteins are usually deputed to sustain tension in a cell They are made of a single long polynucleotide chain structured in multiple similar domains (like beads on a string) When pulled, the domains fall apart one at a time: even if virtually identical it is very unlikely that two break down simultaneously. As soon as one opens up, the tension drops, as the free elastic chain is suddenly longer. Pulling modular constructs (tandem repeats of molecular events) Key advantages of modular proteins: they provide easily recognizable molecular events (sawtooth pattern) they give several measurements on the same (or similar) event within one curve they provide a simple method to distinguish from a force peak due to a molecular event and that due to chain release from the probe (the last event) The distance between the peaks correlates with the length of the polypeptide chain set free by the unfolding non-specific domains unfolding chain release Advantages are such that researchers make polyproteins (or other similar synthetic constructs) to arrange interactions in tandem and make the pulling of non-modular systems behave like modular ones

17 Proteins can be unfolded and also refolded By reverting the direction of probe motion, the elastic tension is released and unfolded structures can refold. Refolding time can be different for different structures. The AFM can also test this. Force spectroscopy data should be dealt with statistically -There are experimental errors both in the force and in the distance measurements (due to thermal noise, error in the cantilever calibration, measurement errors on the force curves) - There is not a unique value for the rupture force of a bond, since bonds break due to a stochastic process a force distribution arises. Myosin II coiled coil: a topologically simple protein behaves as truly elastic springs Many thousand force curves must be gathered and the event forces and lengths then measured from the curves (and interpreted as distributions) Fn-bacteria Most probable rupture force at pn s -1 Titin: a more complex protein, the unfolding and the re-folding opf which proceeded via different pathways X. Zhuang, M. Rief Curr. Op. Str. Biol: 2003 Molecular characteristics are also gathered from statistical models The worm-like chain model is usually employed to fit the F vs extension curve and to derive contour ubiquitin length and persistence length information. i i 7 kbt 1 1 x x F a i Lp 4(1 x / Lc ) 4 Lc i 2 Lc Bouchiat et al. (1999) defined parameters a i AFM force spectroscopy: what are Position-ramp and Force-clamp? Velocity clamp vs force clamp In velocity clamp, the linear velocity of the pulling (or refolding) is constant. The force changes significantly during these experiments [film/animazione] Force Clamp: an operational mode in which the pulling force is set to a fixed value and the piezo reacts to changes in the system in order to maintain such force constant. Julio Fernandez (Columbia University) was the first to exploit the powers of force-clamp pulling modes in AFM, while this pulling mode has been used frequently with optical tweezers or similar apparatuses. In a force-clamp experiment, a feedback loop keeps the measured force constant. To do this, the system continuously adjusts the separation between the probe and the surface, also to take into account molecular events (unfolding, refolding) Unfolding of titin in the two regimes

18 Protein unfolding and refolding at controlled force After having stretched a molecule of this protein at a constant high force, the force was quenched to a lower value and kept constant, letting the molecule refold. Afterwards, they raised the force again in order to control if the refolding was successful Unfolding and refolding of ubiquitin (modular protein) The force-step mode: refolding at controlled force stage 1: very fast, collapse into a semi-compact globule, most likely driven by the elastic recoil of the stretched polypeptide stage 2, 3: slow random search of thousands of transition states that can be reached from this form stage 4: a rapid folding collapse once a transition state is found (the formation of long-range tertiary contacts through the water expulsion from the partially hydrated hydrophobic core?) (J. M. Fernandez, H. Li, Science 2004, 303, ) This experiment is just a beginning attempt to controlled refolding under force It has been criticized a lot Even though the protein is modular, refolding does not show step-wise features (except in one case) Kinetics studies are simple in force-clamp mode: the kinetics of disulfide bridge reduction in multi-modular proteins [J. Fernandez et al.] Refolding of ubiquitin can display steps This new type of instrument can pave the way to a number of interesting experiments. Since the force at which a process takes place is constant and known, the interpretation of the events should be simpler. Experiments can be made in different conditions and then also extrapolated to limit cases (such as to have zero-force kinetics!)

19 K1 2 K2 * 3 1 ANGIOSTATIN AND ANGIOGENESIS K3 * K4 Human Angiostatin K5 Angiostatin acts within the ECM and binds transmembrane receptors of endothelial cells (integrins, ATPase). Angiogenesis inhibitor Clinical trials as anticancer therapy Mechanism of action still undetermined Mechanical unfolding of angiostatin Bustanji Y, Samorì B Angew. Chem., 41 (9), , 2002 When we stretch angiostatin by an AFM tip we do mimic a process that should take place in-vivo on the surface of cells Angiostatin is natively subjected to pulling forces FORCE REGULATED MECHANISM OF ACTION? Mechanical unfolding of angiostatin Bustanji Y, Samorì B Angew. Chem., 41 (9), , 2002 Each domain has a triple-loop topology defined by three internal disulphide bonds No sequences of saw tooth peaks typical of multimodular proteins 100 pn 20 nm Only one peak is obtained, instead The disulphide bonds can withstand forces up to a few nn (Grandbois et al., 1999) They act as a mechanical barrier to mechanical unfolding

20 Mechanical unfolding of angiostatin Bustanji Y, Samorì B Angew. Chem., 41 (9), , 2002 The reduction of the disulphide bridges opens topological loops and makes them accessible to mechanical unfolding Mechanical unfolding of angiostatin Bustanji Y, Samorì B Angew. Chem., 41 (9), , 2002 The spacing between two subsequent peaks reflects the number of amino acids that each unfolding event added to the total length of the protein under tension 20 nm 14 nm = 40 a.a. 5 mm 100 pn 5 mm DTT 100 pn 20 nm DTT saw tooth peaks Length increments L c = 14 nm Mechanical unfolding of angiostatin Bustanji Y, Samorì B Angew. Chem., 41 (9), , 2002 The reduction of more interior disulphide bonds adds contour length to the elongation of the protein under tension Mechanical unfolding of angiostatin Bustanji Y, Samorì B Angew. Chem., 41 (9), , 2002 The single peaks can be assigned to the different thiol/disulphide intermediates 14nm 21nm 29nm # of amino acids added Length increments 14 nm 21 nm 29 nm

21 Mechanical unfolding of angiostatin Bustanji Y, Samorì B Angew. Chem., 41 (9), , 2002 Evaluate the distributions of the intermediates in different reducing conditions 14nm 21nm 29nm Steered molecular dynamics to simulate force spectroscopy We simulate step-by-step the unfolding of a protein structure in silico. Very computationally intensive. Details of the mechanical unfolding pathways at atomic detail Identification of candidate critical interactions Structural characterization of intermediate conformations No mm DTT No mm DTT No mm DTT In silico simulated conditions are often far from the experimental and physiological ones (unrealistic high speeds, water problem) Length increments L c (nm) (nm) L c L c (nm) Traditional ensemble-average approach: block thiols with specific reagents and then fractionate the intermediates SMD simulation of the unfolding of Angiostatin K2 modulus [film/animazione] The single-molecule force-spectroscopy data on Angiostatin show: Inspiration from multi-modular proteins: Ni-NTA-His-tag bond strength revisited 1) how a redox environment can modulate the mechanical properties of angiostatin; 2) how this modulation relies, at the single-molecule level, on the extent of reduction of the disulfide bonds; 3) how, at the level of a large sample of molecules, the distribution of the different thiol/disulfide intermediates after reduction can be estimated by statistical analysis of the force curves. 250 pn 100 nm Valle et al. Angew. Chem. 2008

22 An example Study of polymer desorption from surfaces with the AFM: Loops and trains can be identified and their dimension can be evaluated AFM-based force spectroscopy to study polymer desorption from surfaces: DNA from mica. By setting a bridge of DNA between the AFM probe and the mica surface we can measure the force with which the molecule is adsorbed [film/animazione] The dimension of loops is estimated from the contour length increments The dimension of tails or trains from the length of the plateaus In our preliminary experiments, we could measure the force of adsorption of a single DNA molecule to the surface of mica M. Conti, Y. Bustanji, G. Falini, P. Ferruti, S. Stefoni, B. Samorì, ChemPhysChem (2001) 10, 610 The adsorption of DNA on mica Example force curves for the desorption of ds-dna molecules covalently attached to the SFM probe: Force plateaus are recorded approach The interpretation of the distribution of pulling forces for the desorption of ds-dna molecules Multiple molecules can be attached on the probe and they can adsorb on and desorb from the surface at the same time from different locations 100 pn retract Pulling speed ~ 4 µm/s Cantilever Spring Constant ~ 10-2 N/m Buffer solution: 4 mm HEPES, 10 mm NaCl, 2-5 mm MgCl 2 DNA: 1000 bp double-stranded 100 nm

23 The distribution of DNA-pulling plateaus lengths The distribution of plateaus forces for the ds-dna pulling experiments (32±6)pN (60±12)pN No events with a length bigger than the molecule length have been recorded An elementary desorption force of approximately 30 pn is found from the distribution of singleevent measurements (88±8)pN You can also overstretch DNA with the AFM, but that s another story Overstretching del DNA Se il dsdna viene stirato, subisce una transizione conformazionale che svolge l elica in modo simile ad una denaturazione. Il DNA può essere stirato fino ad una lunghezza pari al 70% in più della lunghezza del B-DNA, con una transizione del primo ordine all equilibrio, reversibile a circa 65 pn (come l acqua che bolle). Alla fine della transizione il dsdna si comporta come se avesse l elasticità del ssdna, e tirando ancora si stacca dalla punta dell AFM. Why force? The usual variables chemists use to affect a chemical reaction are temperature and pressure. We consider here an additional variable: force. By attaching a molecule to the tip of a cantilever of an atomic force microscope, or to a bead in a laser light trap, we can control the force on a single molecule. This mechanical force can drive a reaction to completion, or stabilize the reactants. [I. Tinoco Jr., C. J. Bustamante] Reversible & at equilibrium

24 Typical forces and length scales Gathering thermodynamically interesting data from dynamic force spectroscopy A bond or interaction is held together by a potential energy well. The depth of the well defines how stable the interaction is, and characterizes the bond. Simple interactions have energy landscapes profiles like this, with a single well. More complex interactions might have energy landscapes characterized by several energy minima at different depths and locations (intermediates). To break the bond, the system must extend beyond x β, the position of an energy barrier. Sooner or later, it will do it spontaneously, just with the aid of thermal energy. The kinetics of dissociation depends inversely from G. x β G r equil bond dissociation Gaub Research Group, Munchen In a conformational transition (such as protein unfolding), the initial and the final state can both be defined, energetically and structurally Gathering thermodynamically interesting data from dynamic force spectroscopy: the application of force on an energy landscape When a properly oriented pulling force is applied to a system, its energy profile is perturbed. Due to the energy put into the system, the height of the energy barriers is reduced by Fx (progressively more relevant, the farther from the equilibrium distance). This lowering encourages the natural thermal dissociation of the bond, which takes place faster. x β F G the energy landscape can be characterized with proper kinetic experiments, From a theory developed by Bell (1978) and then implemented by Evans (1997) By pulling, the rate of dissociation of a bond increases By pulling at different speeds, one can calculate the height ( G ) and the position (x β ) of the energy barrier governing the reaction so learn about the structure of the transition state!

25 Gathering thermodynamically interesting data from dynamic force spectroscopy: the highest barrier controls thermal dissociation The rate at which a bond dissociation takes place depends on the height of the highest barrier, usually the most external one in unperturbed cases. Since the effect of force in tilting an energy landscape is more relevant far from the equilibrium distance, outer barriers are more affected than inner ones. This implies that there could be a reversal of order in the barrier height in complex energy landscapes. Applying more and more force, it can happen that more internal barriers start to control the dissociation process. What really counts in a common force spectroscopy experiment is the force loading rate (the speed at which increasing forces are applied, pn/s). This increases with the spring constant of the lever and the speed of the pulling. By changing these parameters in the experiments, different force regimes can be sampled. Gathering thermodynamically interesting data from dynamic force spectroscopy: the highest barrier controls thermal dissociation Doing dynamic force spectroscopy (pulling at a range of different speeds and spring constants) can be the only way to learn something about internal energy barriers: their presence, their depth their location common solution (bulk or single molecule) experiments are only dependent on the external barrier An example is for the interaction of biotin and avidin or streptavidin, where the presence of up to three energy barriers has been characterized by sampling several orders of magnitude of loading rate Due to a complex game of interaction lifetimes and energy barrier shapes, the faster one bond is pulled, the highest will be the most probable force at which it will yield: the same bond yields at different strengths! So the strength is not a characteristics of an interaction, but it depends on the conditions A brief physico-chemical consideration If the force is kept constant during an experiment, the system evolves along distinct energy landscape layers, jumping from one to the other when the set force is changed The application or the release of a pulling force shifts the energy landscape of the system and makes thermally spontaneous processes that were not such without applied force. In a velocity-clamp experiment these energy landscape layers cannot be defined. So why do you want to measure forces? - To characterize (the energy landscale of) a bond by forming it and stressing it, or subjecting it to conformational transitions (only way to characterize the structures of transition states) - To measure the length of a polymer that is interested in a structured domain - To characterize the flexibility of a chain - To evaluate the mechanical resistance in structures that are subjected to forces - To characterize the kinetics of unfolding and refolding of proteins - To characterize the interaction of small molecules with (the formation and break-down of) structures Samorì, Zuccheri, Baschieri, ChemPhysChem 2004