1. Le Omeoproteine ( Homeodomain proteins )

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1 SOMMARIO Nella tesi è analizzata, mediante tecniche istochimiche, l'inattivazione del gene prep1.1 nel teleosteo Danio rerio, un organismo modello per la genetica e la biologia dello sviluppo dei vertebrati. prep1.1 codifica per un cofattore di trascrizione importante nella determinazione dello sviluppo del neuroectoderma. La sua inattivazione ottenuta iniettando uova fecondate con un oligonucleotide antisenso per l'rna messaggero di prep1.1, risulta in embrioni che presentano una alterata struttura del romboencefalo e le cui cellule delle creste neurali non si differenziano in cartilagine. Ho inoltre avviato il sequenziamento del gene prep1.2 (paralogo di prep1.1), e ne ho determinata l'espressione nei primi stadi dello sviluppo a livello delle cellule delle creste neurali. I due geni sembrerebbero quindi entrambi controllare gli stadi differenziativi delle cellule derivate dalle creste neurali. 5

2 INTRODUZIONE I vertebrati presentano uno schema corporeo segmentale che appare evidente nel tronco e nella coda, dove fin dalle prime fasi dello sviluppo il mesoderma dorsale si suddivide nei somiti, precursori di metamerici di vertebre e muscoli. Altre strutture metameriche sono i nervi spinali che fuoriesono a coppie ai lati di ogni vertebra. La testa è solo apparentemente priva di segmentazione e nello sviluppo precoce dei vertebrati si evidenzia che questa metameria interessa strutture di origine mesodermica, neurodermica ed endodermica. I nervi cranici possono essere paragonati in base al tipo di fibre nervose, alle radici dei nervi spinali oppure ai nervi spinali di anfiosso e lampreda in cui le radici dorsale e ventrale rimangono completamente separate. Le radici ventrali dei nervi spinali sono quelle che accolgono solo fibre motrici somatiche ed innervano i muscoli somatici; questi ultimi si sviluppano dai miotomi dei somiti, e i somiti sono strutture metameriche. Per questa ragione le radici ventrali sono delle strutture segmentali. Nel capo, come nel tronco e nella coda le fibre motrici somatiche sono connesse con i miotomi. Tre piccoli e piuttosto aberranti somiti pre-otici danno origine ai muscoli estrinseci dell occhio; ciascuno ha il proprio nervo, rispettivamente il III, il IV ed il VI. I somiti posteriori del capo formano i muscoli ipobranchiali nei pesci e la muscolatura della lingua nei tetrapodi e sono innervati dai nervi spino-occipitali e dall ipoglosso (XII) loro omologo nei tetrapodi, tutti questi costituiti esclusivamente da fibre somatomotorie. La disposizione segmentale è mantenuta. Il problema sorge quando si sviluppa l orecchio interno, questo occupa lo spazio che dovrebbe di norma contenere dei somiti e, necessariamente, la sequenza dei somiti viene interrotta. I nervi formati dalle radici dorsali, o branchiali, costituiscono una serie che però non è connessa ai miotomi o ad altre strutture somatiche, ma ad elementi viscerali, sia scheletrici che 7

3 muscolari, associati alle branchie. Perciò, il trigemino (V) è il nervo dell arco mandibolare, il faciale (VII) dello ioideo, il glossofaringeo (IX) innerva il primo arco branchiale, mentre gli altri quattro archi branchiali sono innervati ciascuno da una branca del nervo vago (X). Quindi si può ipotizzare che ci sia un unico schema corporeo al quale ubbidiscono i miotomi, i nervi cranici, gli archi viscerali e le tasche branchiali. In questo contesto si inserisce la capacità di alcune cellule di migrare durante lo sviluppo embrionale, le cellule delle creste neurali hanno questa attività, sono pluripotenti, ed esclusivamente nella testa danno origine a tessuti come cartilagini e ossa che altrove derivano dal mesoderma. Si può affermare che la faccia è in gran parte il prodotto delle creste neurali cefaliche e il differenziamento della mandibola, dei denti, e delle cartilagini della faccia dipende dalla localizzazione di queste cellule. Il romboencefalo è segmentato lungo l asse antero-posteriore in rombomeri. In pollo le creste neurali della testa migrano in base al loro rombomero di origine attraverso tre principali vie (Figura 1) (Creuzet et al., 2002; Lumsden e Keynes 1989). Nella prima di queste vie le cellule derivate dal mesencefalo e dai primi due rombomeri migrano nell arco mandibolare e generano il ganglio del trigemino. Nella seconda le cellule derivate dal rombomero 4 migrano nell arco Figura 1: Rappresentazione schematica della migrazione delle creste neurali in un embrione di pollo. I numeri romani indicano i nervi cranici che innervano gli archi viscerali indicati dai numeri arabi 1-4. Abbreviazioni: 1, arco mandibolare; 2, arco ioideo; 3-4; primo e secondo arco branchiale; Di, diencefalo; Ames, mesencefalo anteriore; Pmes, mesencefalo posteriore; NFB, abbozzo naso-frontale; r1-8, rombomeri, r8 si sviluppa tardivamente rispetto agli altri rombomeri (Creuzet et al., 2002). ioideo e originano i gangli del faciale e dello stato-acustico (VIII). Nella terza via le cellule delle creste neurali che derivano dal rombomero 6, migrano negli archi branchiali, danno origine a ghiandole (timo, tiroide e paratiroidi) e ai gangli del 8

4 glossofaringeo e del vago. Le cellule delle creste neurali derivate dai rombomeri 3 e 5 muoiono per apoptosi, o si uniscono all uno o all altro dei vicini gruppi migranti. Nei mammiferi gli archi viscerali permangono negli individui adulti e corrispondono agli ossicini dell orecchio medio, martello, incudine e staffa, allo ioide e alle cartilagini della laringe. Alla base di questi processi differenziativi si trovano determinati geni regolatori che, generalmente, codificano per specifici fattori trascrizionali. Questi ultimi regolano l espressione di geni bersaglio che, come parte di una complessa cascata di segnali intracellulari, intervengono nel differenziare le specifiche regioni del tubo neurale. 1. Le Omeoproteine ( Homeodomain proteins ) Un importante gruppo di fattori trascrizionali è caratterizzato da una regione proteica definita omeodominio, altamente conservato dal lievito all uomo. Attraverso di esso, le proteine sono in grado di legarsi al DNA e regolare l espressione dei geni bersaglio, giocando un ruolo essenziale nel processo di differenziamento del sistema nervoso. Nei vertebrati i geni hox specificano, ad esempio, la precisa identità dei rombomeri, i diversi segmenti del romboencefalo (Krumlauf, 1994; Lumsden e Krumlauf, 1996; Moens e Prince, 2002; Prince et al., 1998). L inattivazione di geni hox espressi dalle creste neurali della testa dà luogo alla perdita di identità della regione di interesse che acquisisce le caratteristiche morfologiche di quelle vicine, e anche da trapianti di cellule delle creste neurali dalla loro sede di origine in un contesto cellulare, si dimostra che esse hanno già un identità definita e determinano la morfologia della struttura a cui appartengono. Le proteine contenenti un omeodominio ( Homeodomain proteins ) costituiscono una super-famiglia di fattori di trascrizione caratterizzati da un dominio molecolare di 60 amminoacidi (omeodominio) che si lega a determinate regioni del DNA. In questo modo vengono attivate precise batterie di geni che specificano le proprietà di ogni segmento del corpo. Questi fattori di trascrizione sono infatti fondamentali per il 9

5 corretto sviluppo di un asse A/P sia nei vertebrati che negli invertebrati. L omeodominio è codificato da una sequenza di DNA di 180 pb altamente conservata e conosciuta come homeobox (individuato per la prima volta nel 1984 all interno dei geni omeotici Antp e Ubx di D. melanogaster). Attraverso questa regione, la proteina è in grado di legarsi a specifiche sequenze di DNA, regolando l espressione genica. La funzione di questi fattori di trascrizione è quindi essenziale per specificare, nel corso dello sviluppo embrionale, il destino differenziativo di ogni cellula. A livello molecolare, l omeodominio possiede una struttura secondaria definita da tre α-eliche. Due di esse generano una conformazione a elica-giro-elica ( helixturn-elix ), caratteristica di quei fattori trascrizionali che si legano al solco maggiore del DNA. La terza α-elica, invece, è la regione di amminoacidi in grado di riconoscere e legare in maniera specifica le basi puriniche e pirimidiniche. Una proteina che possiede un omeodominio è quasi certamente un fattore trascrizionale. Di conseguenza, i geni che contengono un homeobox (omeogeni) risultano essere elementi fondamentali per la regolazione dell espressione genica e per il corretto sviluppo embrionale. Questo ha spinto la ricerca ad individuare un numero molto elevato di omeogeni contenenti un homeobox molto conservato. Sulla base della sequenza amminoacidica primaria, gli omeodomini possono essere suddivisi in classi differenti, a seconda del loro grado di omologia con la sequenza prototipo codificata dall homeobox del gene omeotico Antp di D. melanogaster. 2. I geni hox Nei vertebrati, il gruppo più conosciuto e studiato di omeoproteine viene codificato dai geni hox, espressi nel romboencefalo ed in regioni posteriori, che governano lo sviluppo del corpo lungo l asse cefalo-caudale, attraverso un espressione combinata ma selettiva per ciascun segmento (Krumlauf, 1994; Moens e Prince, 2002). In tutti i vertebrati la polarità cefalo-caudale viene specificata attraverso l espressione dei geni hox già alla gastrulazione. Questi geni sono gli 10

6 omologhi di quelli che costituiscono, in D. melanogaster, il complesso omeotico (HOM-C) (Lewis, 1978) e giocano un ruolo fondamentale nello specificare l identità dei diversi segmenti lungo l asse A/P dell embrione. Il complesso HOM-C comprende due gruppi di geni (i primi homeobox ad essere stati scoperti) sul cromosoma 3, definiti come Antennapedia e Bithorax (figura 2), i quali possono essere però considerati un unica unità funzionale (in altri insetti, come il Tribolium, nel nematode Caenorhabditis elegans e nell anfiosso esiste un unico complesso omeotico). I geni del complesso HOM-C sono disposti sul cromosoma nello stesso ordine con cui vengono espressi lungo l asse antero-posteriore del corpo. Il gene labial, ad esempio, è quello più vicino all estremità 3 e regola lo sviluppo delle strutture più anteriori. Al contrario il gene AbdB, che si trova più spostato verso il 5, specifica lo sviluppo della porzione più posteriore dell addome. L espressione di ogni gene omeotico determinerà, infine, il fenotipo di ogni cellula che, assieme alle altre, contribuirà all identità complessiva del segmento al quale appartiene. Il fenotipo risultante da mutazioni in uno di questi geni consiste in una Complesso Antennapedia Complesso Bithorax lab Pb Dfd Scr Antp Ubx AbdA AbdB Figura 2: Rappresentazione grafica dei due complessi omeotici situati sul cromosoma 3 di D. melanogaster. Una prima regione, definita Antennapedia, contiene i geni labial (lab), proboscipedia (pb), deformed (dfd), sex combs reduced (scr) ed antennapedia (antp). I geni lab e dfd specificano i segmenti della testa, mentre scr e antp conferiscono l identità ai segmenti toracici. La funzione di pb sembra essere importante solo nell adulto ma, in sua assenza, i palpi labiali divengono zampe in seguito ad una trasformazione omeotica (Wakimoto et al., 1984; Kaufman et al., 1990). La seconda regione cromosomica è definita Bithorax e contiene i geni ultrabithorax (ubx), abdominala (AbdA) e abdominalb (AbdB). Ubx specifica l identità del terzo segmento toracico mentre AbdA e AbdB sono geni essenziali per il corretto sviluppo dei segmenti addominali. Antennapedia e Bithorax costituiscono, nell insieme, un'unica unità funzionale definita complesso omeotico HOM-C. 11

7 trasformazione di strutture appartenenti ad un segmento in quelle appartenenti ad una altro (omeosi): ad esempio si sviluppa un antenna al posto di una zampa. La funzione dei geni omeotici di D. melanogaster rispecchia quella svolta dai geni hox dei vertebrati. Diversi esperimenti hanno infatti dimostrato che mutazioni a cui consegue la perdita di funzione di uno o più geni hox, causano la scomparsa dell identità di determinati segmenti lungo l asse A/P del corpo (Rijli et al., 1993; Gendron-Maguire, 1993; Horan et al., 1995; Studer, 1996). Contrariamente al moscerino della frutta, i vertebrati possiedono più gruppi di geni omeotici disposti ognuno su un cromosoma differente, probabilmente originatisi nel corso dell evoluzione mediante un meccanismo di duplicazione e divergenza. Nei tetrapodi, ad esempio, esistono quattro clusters di geni hox (hox a-d), come nel topo, nell uomo e nel pollo (McGinnis e Krumlauf, 1992). D. rerio ed altri teleostei possiedono, invece, sette gruppi di geni hox (Prince et al., 1998; Amores et al., 1998) e ciò suggerisce un ulteriore evento di duplicazione genica nella linea evolutiva degli organismi appartenenti a quest ordine. Nonostante queste differenze, in tutti i vertebrati possiamo riconoscere 13 gruppi paraloghi di geni hox, ognuno dei quali comprende i geni equivalenti dei diversi complessi omeotici che mostrano un estesa omologia di sequenza (figura 3). Cambiamenti nell espressione di geni hox causano trasformazioni omeotiche per cui, ad esempio, le strutture più anteriori possono acquisire il carattere di regioni più caudali (Krumlauf, 1994). Come in D. melanogaster è stato dimostrato che anche nei vertebrati l espressione di ogni gene hox rispecchia la sua posizione all interno del complesso omeotico sul cromosoma (colinearità): ad esempio il gene più spostato verso l estremità 3 è quello espresso più anteriormente nell embrione e mano a mano che ci si avvicina al 5 l espressione genica si fa più caudale. (Gaunt et al., 1988; Graham et al., 1989; Peterson et al., 1994; Duboule e Dolle, 1989; Dekker et al., 1992; Godsave et al., 1994). Nella maggior parte dei casi, l espressione dei geni hox è strettamente correlata con i confini tra i vari segmenti od i punti di maggior transizione morfologica lungo l asse dell embrione (Burke et al., 1995; Horan et al., 1995; Lumsden e Krumlauf, 12

8 1996;). Questo è evidente soprattutto a livello del romboencefalo, suddiviso lungo l asse rostro-caudale in una serie di segmenti definiti rombomeri che giocano un ruolo importante nell organizzazione e nella funzione della testa dei vertebrati (Guthrie, 1996; Lumsden e Krumlauf, 1996). I rombomeri rappresentano zone di sviluppo separate ognuna con un differente destino differenziativo e danno origine, ad Gruppi paraloghi Topo-Hoxa A Zebrafish - hoxaa hoxab Hoxb B hoxba hoxbb Hoxc C hoxca hoxcb D Hoxd hoxda Figura 3: Rappresentazione grafica dell organizzazione dei geni Hox in topo ed in zebrafish. Come si può notare, i geni Hox di topo (raffigurati in arancione) sono distribuiti in quattro clusters omeotici (A, B, C, D) localizzati ognuno su un diverso cromosoma. In zebrafish, invece, sono presenti sette gruppi di geni Hox (in verde). I clusters genici derivati tramite duplicazione dei gruppi Hoxa, Hoxb, Hoxc e Hoxd sono indicati come Hoxaa/Hoxab, Hoxba/Hoxbb etc. Ognuno dei 13 gruppi paraloghi comprende geni Hox con alta omologia di sequenza. Tutti i geni di uno stesso insieme, infatti, derivano da duplicazioni multiple iniziate da un unico gene Hox ancestrale. Il rettangolo nel cluster hoxaa di zebrafish rappresenta uno pseudogene omeotico. 13