Corso di Chimica Analitica 2 e Laboratorio. Separazione di aminoacidi mediante cromatografia su strato sottile

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1 Corso di Chimica Analitica 2 e Laboratorio Docenti: Davide Atzei e Antonella Rossi Separazione di aminoacidi mediante cromatografia su strato sottile 1 INTRODUZIONE La cromatografia viene definita dalla IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) come: "Metodo, usato primariamente per la separazione dei componenti di un campione, in cui i componenti vengono distribuiti tra due fasi, una delle quali è fissa mentre l'altra è mobile. La fase stazionaria può essere un solido, o un liquido supportato su un solido, o un gel. La fase stazionaria può essere impaccata in una colonna, distribuita a formare uno strato, o distribuita come un film, etc.; in queste definizioni "letto cromatografico" è usato come termine generale per denotare una qualsiasi delle varie forme in cui può essere usata la fase stazionaria. La fase mobile può essere un gas o un liquido. Nel sistema cromatografico ciascuna componente è ritardata in funzione della sua interazione con la fase stazionaria (fase fissa) e con la fase mobile (eluente). In particolare, il flusso del solvente porterà ogni sostanza dal punto di applicazione verso l estremità opposta della fase stazionaria. Se il composto non interagisce con la fase stazionaria migra con il fronte del solvente altrimenti, se trattenuto, subisce un rallentamento. Nella cromatografia su strato sottile l analisi qualitativa si basa sul fatto che il percorso di ciascuna componente (visibile in molti casi come macchia sulla fase fissa) dipende dal ritardo di migrazione, chiamato anche fattore di ritenzione o fattore di ritardo, di ogni composto rispetto al fronte della fase mobile; il ritardo di migrazione è selettivo e dipende dal sistema fase fissa/fase mobile impiegato, dalla temperatura e dal tipo di composti da separare. I diversi componenti si separano in modo caratteristico per cui ciascuno ha uno specifico rapporto, R f, determinato come segue: R f = R p ; R s dove: Rp = distanza tra il punto di applicazione ed il centro della macchia della componente Rs = distanza tra il punto di applicazione ed il fronte del solvente. Questo rapporto è un dato caratteristico per il riconoscimento delle sostanze. È spesso influenzato da variabili che non è facile tenere sotto controllo per cui ne risulta una certa carenza di ripetibilità e di riproducibilità. È spesso preferibile ricorrere alla determinazione degli Rf relativi. Per questo si unisce al campione una sostanza di riferimento ad Rf esattamente noto ed appartenente alla stessa categoria di composti da separare. Se H è la distanza del riferimento dalla linea di partenza ed X, Y, Z le distanze da questa linea delle sostanze separate, gli Rf relativi delle singole sostanze sono dati da: R f,x = X H ; R f,y = Y H ; R f,z = Z H ; 1

2 La cromatografia su strato sottile è circa tre volte più veloce della cromatografia su carta e può essere applicata anche quando sono disponibili piccole quantità di campione. Si può applicare per scegliere le condizioni da usare per separazioni su larga scala. E applicata in molti campi come la diagnostica clinica, la chimica forense ed il controllo di qualità. 2 OBIETTIVI Gli allievi dovrebbero: - prendere dimestichezza con la tecnica TLC (thin layer chromatography = cromatografia su strato sottile) e le sue applicazioni in campo analitico; - usare la TLC per separare ed identificare una miscela di aminoacidi 3 MATERIALE OCCORRENTE Strumentazione Lastrina di vetro con strato di gel di silice mesh Matita e righello asciuga-capelli camera di sviluppo di vetro lampada UV stufa Reattivi Soluzione di butanolo acqua - acido acetico (4:2:1) Soluzione standard di: - alanina 1mg cm -3 soluzione alcolica 0.5M HCl - lisina 1mg cm -3 soluzione alcolica 0.5M HCl - triptofano 1mg cm -3 soluzione alcolica 0.5M HCl - glicina 1mg cm -3 soluzione alcolica 0.5M HCl Soluzione con la miscela incognita di aminoacidi. Ninidrina (2,2-diidrossi-1,3-diossoidrindene): Per preparare la soluzione di ninidrina aggiungere 3 cm 3 di acido acetico glaciale a 100 cm 3 di una soluzione allo 0.3% di ninidrina in n-butanolo. E obbligatorio lavorare sotto cappa, ed indossare gli occhiali di sicurezza ed i guanti. Gel di silice mesh 2

3 Vetreria Siringa da 5 microlitri Nebulizzatore per la soluzione di ninidrina Essiccatore 4 PROCEDIMENTO Si prepari la camera (o vasca) di eluizione versando una miscela di butanolo acqua acido acetico (4:2:1); il livello del solvente deve essere di circa mezzo centimetro; si copra la camera con l apposito coperchio per saturarla con i vapori del solvente. Si prepari la lastrina per TLC (attivazione della lastrina: si ponga la lastrina in stufa a 110 C per circa un ora e, quindi, si lasci raffreddare in essiccatore). Si eviti di toccare la lastra con le mani: le dita possono lasciare le impronte sulla lastra e contaminarla. Le lastrine a vostra disposizione potrebbero essere già attivate: chiedere al docente. Si segni leggermente con la matita e con l aiuto del doppio decimetro la linea di base a circa 1 cm dal bordo inferiore. Lo strato di gel di silice è tenero: state attenti a non graffiarlo. Se la lastrina è rettangolare si scelga uno dei lati minori. Si segnino sulla linea 5 tacche distanziate tra loro almeno di 1 cm. Si applichi la soluzione contenente la miscela di aminoacidi da analizzare con la siringa da 5 microlitri in corrispondenza della prima tacca e, quindi, in corrispondenza delle altre tacche si depositino 5 µl di ciascuna soluzione standard (nel passare da una soluzione all altra si avvini la siringa aspirando e scartando la nuova soluzione almeno una decina di volte!!). Si asciughi la lastrina con un getto di aria calda. Dopo l evaporazione del solvente si inserisca la lastrina nella camera. È indispensabile che la miscela eluente non bagni la goccia, ma che sia ad una distanza di circa mezzo centimetro da essa. Si chiuda di nuovo la vasca con il coperchio. Si aspetti che il solvente risalga sino a ca 1 cm dal bordo superiore. Si tolga il coperchio, si sollevi la lastrina dalla camera e si segni con la matita la linea di risalita del solvente. Nel caso di solventi volatili il segno va posto senza sollevare la lastrina dalla camera. Si asciughi la lastrina sotto cappa con l aria calda evitando che il solvente evapori troppo velocemente (il gel potrebbe gonfiarsi e staccarsi dalla lastrina) e si spruzzi la superficie con la soluzione di ninidrina. Si scaldi a 100 C (in stufa) fino a comparsa delle macchie colorate. La ninidrina reagisce con gli aminoacidi secondo la reazione: 3

4 Si misuri per ciascuna componente e per ciascuno standard il fattore di ritardo (R f ) e si risalga alla composizione del campione. dis tan za percorsa R f = dis tan za percorsa dal dalla macchia fronte del solvente Nota bene: quando si misura la distanza percorsa dalla macchia si deve misurare dal centro della macchia. 5 RIFIUTI SOLIDI E LIQUIDI Le soluzioni devono essere versate nell apposito recipiente sotto cappa avente l etichetta: residui della cromatografia. Ciascun gruppo può tenere le lastrine utilizzate per l esperienza. 6 NORME DI SICUREZZA Adottare le norme indicate nella scheda di sicurezza della ninidrina (allegato 1). In particolare quando nebulizzate la soluzione di ninidrina sulla lastrina lavorate sotto cappa e state attenti a non inalare o a bagnarvi la pelle con la soluzione. 7 GUIDA PER LA STESURA DEL RAPPORTO - Durante l esecuzione dell analisi, registrate sul quaderno di laboratorio tutte le osservazioni: ad esempio, prendete nota della forma del deposito, della sua dimensione, del colore, del tempo di sviluppo e delle difficoltà incontrate. È a disposizione in laboratorio una macchina fotografica digitale in modo da poter documentare le varie fasi dell esperienza. - Rispondete ai quesiti riportati di seguito. 8 QUESITI 1 Cosa esprime il parametro Rf? 2 Quali sono gli aminoacidi della miscela analizzata? Descrivete la procedura seguita per identificare gli aminoacidi. 3 Per potervi fare un idea di quale sia la quantità di campione necessaria per la cromatografia su strato sottile, calcolate quanti µg di campione sono stati deposti per ciascuna macchia. 4

5 9 BIBLIOGRAFIA IUPAC, Analytical Chemistry Division, Raccomandazioni sulla nomenclatura per la cromatografia, regole approvate nel Il documento è disponibile on-line all indirizzo: Renato Cozzi, Pierpaolo Protti, Tarcisio Ruaro - Analisi chimica strumentale C, Metodi cromatografici. Metodi di misura e trattamento dei dati, 1997, Pag. 44, Lab 8 pag 396 Vogel s Textbook of quantitative chemical analysis Longman Scientific & Technical 5 edizione, pag. 229 Giancarlo Amandola e Virginio Terreni, Analisi Chimica Strumentale e Tecnica, Masson Editore, Pag 365. Tabella con i principali dati sulle sostanze chimiche usate in questo esperimento Reattivo formula bruta Classe di tossicità WHC 1 Pittogramma Alanina C 3 H 7 NO 2 F nwg T+ T Xn Xi C O F N Glicina C 2 H 5 NO 2 F nwg Lisina C 6 H 14 N 2 O 2 F nwg Triptofano C 11 H 12 N 2 O 2 F nwg Butanolo C 4 H 10 O 4 1 X Ac acetico C 2 H 4 O X Ninidrina C 9 H 6 O X Acido cloridrico HCl 2 1 X 5