La pompa sodio- potassio ed il potenziale di membrana a riposo LEZIONE NR PSICOBIOLOGIA

Transcript

1 La pompa sodiopotassio ed il potenziale di membrana a riposo LEZIONE NR PSICOBIOLOGIA

2 La pompa sodio-potassio Le pompe ioniche, al contrario dei canali ionici, mobilizzano gli ioni attraverso la membrana plasmatica contro il loro gradiente elettrochimico, e quindi con un trasporto di tipo attivo effettuato grazie ad una continua spesa energetica. Le pompe ioniche sono molteplici, ma per il neurone la più importante fra queste è senza dubbio la pompa Na+/K+, detta anche ATPasi Na+/K+ -dipendente.

3 La pompa sodio-potassio La notevole importanza di questa pompa è resa evidente dal fatto che il suo funzionamento richiede circa il 25% del fabbisogno totale di ATP cellulare dell intero organismo in fabbisogno di riposo, e nei neuroni questa percentuale sale a circa il 70%. La funzione principale di tale pompa è il mantenimento dell omeostasi cellulare attraverso la regolazione del bilancio osmotico e la costruzione del gradiente transmembrana degli ioni Na+.

4 La pompa sodio-potassio Dal punto di vista strutturale la pompa Na+/K+ è composta da 2 sub-unità alpha e beta. La subunità alpha lega l ATP, gli ioni Na+ e K+ e inoltre contiene i siti di fosforilazione che regolano il funzionamento della pompa stessa. La subunità beta è responsabile della localizzazione della pompa sulla membrana plasmatica e dell attivazione dell unità alpha.

5 La pompa sodio-potassio Il funzionamento della pompa può essere schematizzato secondo un modello basato sull acquisizione sequenziale di modificazioni conformazionali, ciascuna delle quali è conseguenza della precedente e causa della successiva. Queste modificazioni, indotte da una serie di fosforilazioni e defosforilazioni la pompa si apre in modo alterno verso l interno e verso l esterno per poi tornare alla configurazione iniziale, pronta per eseguire un nuovo ciclo di funzionamento. Durante ciascun ciclo, la pompa estrude dall interno della cellula 3 ioni Na+ e vi fa entrare 2 ioni K+, ricavando l energia per entrambi i trasporti contro-gradiente, attraverso la degradazione di una molecola di ATP in ADP.

6 La pompa sodio-potassio 1) Nella configurazione iniziale aperta verso l interno, la pompa lega 3 ioni Na+ 2) Il legame con i 3 ioni, attiva la capacità enzimatica di legare 1 ATP ed autofosforilarsi rilasciando un ADP. 3) La condizione di fosforilazione, induce un cambiamento conformazionale che consiste nella chiusura della pompa sul versante intra-cellulare e la contemporanea apertura sul versante opposto. Allo stesso tempo i legami e l affinità della pompa con gli ioni Na+ si riduce e questi vengono rilasciati all esterno del citoplasma. Fig ) Il rilascio dei 3 ioni Na+, permette ai 2 ioni K+ di legarsi al versante esterno della pompa facendo si che il fosfato sul versante interno si stacchi sotto forma di fosfato inorganico (defosforilazione). Questo evento induce un secondo cambiamento conformazionale che chiude la pompa all esterno riaprendola all interno e rilasciando i due ioni K+.

7 La pompa sodio-potassio Riassumendo: ad ogni ciclo la pompa, consumando 1 ATP, causa la fuoriuscita di 3 ioni Na+ ed immette 2 ioni K+. Quindi, se consideriamo solo le cariche elettriche, il risultato complessivo si può riassumere nella perdita netta di una carica elettrica positiva nell ambiente intracellulare OPPURE nell aumento nel citoplasma di una carica elettrica negativa. Per tale ragione, la pompa Na+/K+ è definita elettrogenica, cioè generatrice di una differenza di potenziale tra cariche elettriche intra- ed extra-cellulari. Tuttavia il contributo della pompa alla differenza di potenziale fra i due comportamenti è pari solo al 10%

8 Le pompe protoniche Le pompe protoniche effettuano lo spostamento di ioni H+ contro il loro gradiente di concentrazione, utilizzando l energia fornita dall idrolisi dell ATP. Importanti pompe protoniche sono poste nello spessore della membrana mitocondriale e consentono l accumulo di H+ nella camera mitocondriale esterna Relativamente al SN, pompe protoniche di interesse sono quelle delle vescicole sinaptiche. Tali pompe accumulano H+ dentro delle vescicole creando un gradiente di concentrazione che sarà poi utilizzato in un antiporto per inserire il neurotrasmettitore nelle vescicole.

9 Trasporto di membrana Trasporto passivo Trasporto attivo Trasporto vescicolare Diffusione semplice Diffusione facilitata Primario (ATP) Secondario (Gradiente elettrochimico) Endocitosi Esocitosi UNIPORTO Proteine Carrier (interazione diretta con il materiale di trasporto) Canali ionici Regolati da voltaggio (alta specificità Na+, K+, Ca2+, etc ) Recettori ionotropi Nicotinici o Pentamerici Glutammato camp e cgmp Ca2+ Altre modalità di attivazione Trasportatori ABC Pompa Na+/K+ Altre pompe ioniche Pompe protoniche Antiporto - Simporto Co-Trasporto Proteine Carrier Antiporto - Simporto RECETTORI METABOTROPI NON MEDIANO IL TRASPORTO DIRETTAMENTE, SEBBENE FRA I RISULTATI DELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE POSSA ESSERCI L ATTIVAZIONE DI TRASPORTATORI DI MEMBRANA Recettori metabotropi legati ad attività enzimatica (ligandi = fattori di crescita/ormoni) Tirosin Chinasi Istidina Chinasi Serina/Treonina Chinasi Recettori metabotropi legati alla proteina G Famiglia A, recettori per le monoamine (dopamina, norepinefrina, epinefrina, serotonina) ed i neuropeptidi Famiglia B, recettori per secretina, glucagone e calcitonina Famiglia C, recettori per glutammato e per il Ca2+

10 UNIPORTO Proteine Carrier (interazione diretta con il materiale di trasporto) Trasportatori ABC Canali ionici Regolati da voltaggio (alta specificità Na+, K+, Ca2+, etc ) Recettori ionotropi Nicotinici o Pentamerici Glutammato camp e cgmp Ca2+ Altre modalità di attivazione Pompa Na+/K+ Altre pompe ioniche Pompe protoniche Antiporto - Simporto Co-Trasporto Proteine Carrier Antiporto - Simporto

11 RECETTORI METABOTROPI NON MEDIANO IL TRASPORTO DIRETTAMENTE, SEBBENE FRA I RISULTATI DELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE POSSA ESSERCI L ATTIVAZIONE DI TRASPORTATORI DI MEMBRANA Recettori metabotropi legati ad attività enzimatica (ligandi = fattori di crescita/ormoni) Tirosin Chinasi Istidina Chinasi Serina/Treonina Chinasi Recettori metabotropi legati alla proteina G Famiglia A, recettori per le monoamine (dopamina, norepinefrina, epinefrina, serotonina) ed i neuropeptidi Famiglia B, recettori per secretina, glucagone e calcitonina Famiglia C, recettori per glutammato e per il Ca2+

12 I neuroni sono in grado di sfruttare i gradienti di concentrazione e quindi le cariche elettrostatiche degli ioni a valle e a monte della loro membrana plasmatica per generare e trasmettere lungo la membrana stessa e tra cellule diverse gli stimoli nervosi

13 I neuroni sono in grado di sfruttare i gradienti di concentrazione e quindi le cariche elettrostatiche degli ioni a valle e a monte della loro membrana plasmatica per generare e trasmettere lungo la membrana stessa e tra cellule diverse gli stimoli nervosi

14 Cosa accade alla membrana quando è permeabile ad un solo ione? Nessuna differenza di potenziale

15 Cosa accade alla membrana quando è permeabile ad un solo ione? Nessuna differenza di potenziale

16 Cosa accade alla membrana quando è permeabile ad un solo ione?

17 Cosa accade alla membrana quando è permeabile ad un solo ione?

18 Cosa accade alla membrana quando è permeabile ad un solo ione? Si raggiunge l equilibrio elettrochimico: La forza dovuta al gradiente di concentrazione eguaglia la forza dovuta al gradiente elettrico. FLUSSO NETTO NULLO.

19 Due forze agiscono su una particella carica: La FORZA DI DIFFUSIONE, generata dal gradiente di concentrazione La FORZA ELETTRICA, generata dal gradiente elettrico La concomitanza di queste due forze spinge il flusso ionico all interno o all esterno della cellula.

20 Le diverse concentrazioni degli ioni liberi all interno della cellula Tab. 6.2

21 La natura delle cariche negative intracellulari corrisponde per la maggior parte ai gruppi fosfato elettronegativi delle principali macromolecole che compongono la cellula: Acidi nucleici Proteine fosforilate ATP Nucleotidi mono-, di- e tri-fosfati Tutte queste strutture conferiscono larga parte dell elettronegatività stabile della cellula, in quanto per natura non possono abbandonare il citoplasma, essendo associate a costituenti strutturali ed obbligati. Per tale ragione vengono definiti come anioni fissi (A-). In contrapposizione agli ioni liberi (Na+, K+, Cl-, Mg2+, Ca2+ etc ) che invece possono muoversi velocemente attraverso la membrana plasmatica qualora venga loro fornito un passaggio (canale ionico). L elettronegatività causata dagli anioni fissi all interno della cellula, rende quest ultimo fortemente attrattivo per i cationi liberi e fortemente repulsivo per gli anioni liberi

22 Potassio + Gli ioni potassio rappresentano un buon esempio di equilibrio rispetto alle concentrazioni interne ed esterne della cellula (ioni che entrano = ioni che escono). Questo è possibile grazie all azione sia della pompa Na+/K+ che fa entrare il potassio, sia della presenza di molteplici canali leak o resting per il potassio, perennemente aperti. che ne consentono l uscita per diffusione facilitata secondo gradiente di concentrazione. In altre parole si può definire la membrana plasmatica come altamente permeabile agli ioni K+. Nonostante questo, la concentrazione del potassio è più alta all interno della cellula perché la maggior parte degli ioni potassio rimane attratta dalla forte carica negativa dell ambiente intracellulare. In altri termini, solo gli ioni K+ in eccesso sui cui la forza di attrazione elettrostatica operata dall ambiente citoplasmatico non ha effetto, riescono ad uscire dalla cellula secondo gradiente.

23 Sodio + Nel caso degli ioni Na+, la loro esclusione dall ambiente intra-cellulare ad opera della pompa Na+/K+ non è controbilanciata dalla presenza di canali costantemente aperti, e l unico sodio che riesce ad entrare lo fa grazie ad alcuni trasportatori di membrana che operano co-trasporto attivo secondario, utilizzando il gradiente di Na+ come forma di energia. In altri termini, la membrana plasmatica è altamente impermeabile agli ioni Na+. Il risultato di questa impermeabilità è la generazione di due diverse concentrazioni di Na+ altamente sbilanciate fra interno ed esterno (circa 10 volte).

24 Cloro - Per quanto concerne gli ioni Cl-, le concentrazioni e quindi l equilibrio relativo fra interno ed esterno è paragonabile alla situazione descritta per il K+, sebbene a valori invertiti. Infatti anche il Cl- può attraversare facilmente la membrana grazie alla presenza di canali resting sempre aperti. Tuttavia rispetto al K+, l ingresso secondo gradiente è ostacolato dalla carica generale negativa dell ambiente intracellulare. In condizioni normali questo ione si distribuisce quindi attorno alla membrana.

25 Calcio + Come già visto, il calcio è un importante secondo messaggero cellulare (canali metabotropi) per tali ragioni la sua concentrazione all interno della cellula è mantenuta molto bassa grazie all azione di pompe per il Ca2+ che eliminano questi ioni appena la loro concentrazione sale oltre un determinato livello, così da poter utilizzare l aumento di calcio come segnale per una serie di processi:

26 Magnesio + Gli ioni Mg2+, sono invece essenziali per numerosi fenomeni connessi con l attività enzimatica e con il metabolismo degli acidi nucleici. Per esempio la presenza del Mg2+ è necessaria all assemblaggio della sub-unità minore e maggiore dei ribosomi, nonché per l attività dei vari enzimi ed è come già visto, implicata nell attività dei recettori NMDA.

27 Riassumendo: L interazione degli ioni liberi più abbondanti (Na+, K+ e Cl-) con gli anioni fissi, contribuisce nel costituire un ambiente intracellulare più elettronegativo dell ambiente extracellulare Mentre gli anioni fissi sono non diffusibili, la membrana è altamente permeabile al K+ e al Cl- che si trovano in condizioni pressoché di equilibrio, e scarsamente permeabile al Na+ facendo si che questo sia in un forte stato di disequilibrio elettrochimico, attivamente mantenuto grazie alla pompa Na+/K+. Un improvvisa apertura dei canali ionici per il Na+ può causare una immediata ed imponente alterazione delle distribuzioni transmembrana degli ioni e quindi del bilancio complessivo extra- intracellulare.

28 L elettrofisiologia intra-cellulare Un campo di studio che nasce dalle ricerche di Young, Hodgkin & Huxley. Si basa sull idea che l ambiente esterno ed interno della cellula siano due compartimenti distinti caratterizzati da un elevata conduttività elettrica, separati da una membrana con una elevata resistenza elettrica. E pertanto possibile misurare la differenza di potenziale elettrico (differenza di voltaggio) proprio come si fa nei circuiti elettrici, grazie al Voltmetro. Volt = unità di misura della differenza di potenziale Ampere = intensità della corrente elettrica

29 La misurazione del potenziale di membrana Potenziale di membrana a riposo

30 La misurazione del potenziale di membrana Grazie alla tecnica del patch (regione cellulare contenuta nel diametro della micropipetta) clamp è possibile studiare ed analizzare il flusso di ioni attraverso pochi od addirittura un singolo canale ionico.

31 La misurazione del potenziale di membrana Tutte le cellule (non solo le cellule eccitabili) hanno un potenziale di riposo (resting): una carica elettrica attraverso la membrana plasmatica, con l interno della cellula negativo rispetto all esterno. Il valore del potenziale di riposo varia, ma nelle cellule eccitabili si aggira tra -90 e -70 mv.

32 La misurazione del potenziale di membrana L equazione di Goldman Consente di calcolare il valore del potenziale di membrana a riposo in funzione delle variabili che ne determinano il valore, quali la concentrazione e la resistenza della membrana. R = costante dei Gas T= temperatura in gradi Kelvin F = costante di Faraday (96500 coulomb/grammo equivalente di carica) Ln = logaritmo naturale Pna, PK, PCl = permeabilità della membrana agli ioni in questione [ ] = concentrazioni interne ed esterne

33 La misurazione del potenziale di membrana L equazione di Nernst La relazione che esiste all equilibrio tra gradiente chimico e gradiente elettrico fu stabilita dal chimico-fisico tedesco Walter Nernst, grazie alla sua formula che consente di calcolare il potenziale di equilibrio del singolo ione, ovvero il valore del potenziale di membrana nella condizione di massima permeabilità della membrana per quello ione RT Ex zf ln [X] [ X] E I R= costante dei gas T= temperatura assoluta (Kelvin) z= valenza dello ione F= costante di Faraday (96500 coulomb/grammo equivalente di carica) [X] i = Concentrazione intracellulare dello ione X [X] E = Concentrazione extracellulare dello ione X

34 La misurazione del potenziale di membrana L equazione di Nernst consente di calcolare il valore di equilibrio elettrochimico del singolo ione. Nel caso del neurone è possibile osservare un forte disequilibrio a carico del Sodio e del Calcio. Fig Tab. 6.3 Disequilibrio elettrochimico Equilibrio elettrochimico Equilibrio elettrochimico Disequilibrio elettrochimico

35 Il potenziale a riposo In conclusione, la condizione di elettronegatività dell ambiente intra-cellulare rispetto all esterno ha importanti conseguenze per quanto concerne la distribuzione delle cariche elettriche negli immediati dintorni dei due versanti della membrana plasmatica. Tale condizione causa un addensamento di cariche elettriche positive sulla facciata esterna della membrana e questo addensamento richiama cariche elettriche negative all interno. Fig Pertanto le due facce della membrana sono ricoperte di cariche opposte che si attraggono ma che non possono annullarsi per via della separazione della membrana. Se analizziamo la natura di queste cariche, appare chiaro che le cariche positive sulla faccia esterna non possano essere altro che ioni Na+, che dei tre ioni principali (Na, K e Cl) sono gli unici in forte disequilibrio elettrochimico ed una forte concentrazione nell ambiente extra-cellulare.

36 Il potenziale d azione e le sinapsi LEZIONE NR PSICOBIOLOGIA

37

38 Le fasi del potenziale d azione Il potenziale d azione consiste in una brusca e transitoria modificazione del potenziale di membrana neuronale che può essere suddiviso in 3 fasi ben distinte fra loro: Fase di salita (forte depolarizzazione) Fase di discesa (forte iperpolarizzazione) Fase di recupero (lieve depolarizzazione) Il potenziale d azione è innescato dal raggiungimento da parte della membrana, del valore soglia (-55 mv) d apertura dei canali voltaggiodipendenti del Na+

39 + 56 mv - 89 mv

40 Durata e ampiezza del potenziale d azione In aggiunta alle 3 fasi descritte in precedenza, Il potenziale è caratterizzato anche da due importanti parametri: Durata. Nella maggior parte dei casi, corrisponde a circa 4-6 msec e dipende in modo diretto dalle cinetiche di apertura e successiva obliterazione dei canali voltaggio dipendenti del Na+ e K+, e quindi dagli specifici sottotipi di canali (isoforme) espressi sulle membrane neuronali. Ampiezza. Corrisponde invece alla variazione del potenziale fra il picco di massima depolarizzazione ed il picco di massima iperpolarizzazione. Non dipende direttamente dai canali, ma dalla concentrazione degli ioni liberi presenti nell ambiente intra- ed extra-cellulare. La conseguenza di questo è che tutti i potenziali generati nello stesso neurone hanno sempre un ampiezza simile e che per il neurone, l unica alternativa possibile è l emissione o la non-emissione di un potenziale d azione (fenomeno tutto-o-nulla).

41 Riassumendo

42 Auto-rigenerazione del potenziale d azione Il potenziale d azione si svolge in una regione specifica della regione di membrana, di estensione molto limitata, e pertanto rappresenta un fenomeno locale. Tuttavia il potenziale d azione influenza fortemente anche la distribuzione delle cariche elettriche nei suoi immediati dintorni generando un gradiente di depolarizzazione che porterà i canali voltaggio-dipendenti, negli immediati dintorni a raggiungere il loro valore soglia, consentendo la propagazione del potenziale.

43 Riassumendo

44 Propagazione negli assoni non mielinizzati

45 Propagazione negli assoni non mielinizzati (saltatoria)

46 Modulazione dello stimolo nervoso Come detto, il potenziale d azione è definito come un fenomeno tutto o nulla pertanto non è possibile modularne la sua intensità così come avviene ad esempio con il volume della nostra voce. Si pone a questo punto il problema di come i neuroni possano modulare l intensità degli stimoli nervosi. La soluzione adottata è nella variazione della frequenza di emissione (treni di potenziali)

47 Modulazione dello stimolo nervoso

48 Le sinapsi Le giunzioni sinaptiche chimiche hanno il compito di trasformare l informazione elettrica in informazione chimica e sono composte da: Giunzione pre-sinaptica Spazio inter-sinaptico Giunzione post-sinaptica

49 Fig Asso-dendritica, Asso-assonica, Asso-somatica, Autapsi

50 I neurotrasmettitori Sono molecole che mediano la trasmissione uni-direzionale dello stimolo nervoso a livello delle sinapsi chimiche. Vengono convenzionalmente divisi in: Neurotrasmettitori classici (piccole dimensioni, reazioni elettriche o metaboliche rapide) Neuropeptidi (grandi dimensioni, funzioni più complesse, dinamica lenta e continua) I neurotrasmettitori a basso peso molecolare vengono sintetizzati nel citosol della terminazione presinaptica e, successivamente, mediante trasporto attivo, sono assorbiti all'interno delle numerose vescicole presenti nel terminale sinaptico. Quando un segnale giunge al terminale sinaptico, poche vescicole alla volta liberano il loro neurotrasmettitore nella fessura sinaptica. Tale processo avviene in genere nell'arco di un millisecondo. I neuropeptidi, invece, vengono sintetizzati come parti di grosse molecole proteiche dai ribosomi del soma neuronale. Tali proteine sono subito trasportate all'interno del reticolo endoplasmatico e quindi all'interno dell'apparato del Golgi, dove avvengono due cambiamenti. Dapprima, la proteina da cui originerà il neuropeptide viene scissa enzimaticamente in frammenti più piccoli, alcuni dei quali costituiscono il neuropeptide come tale oppure un suo precursore; successivamente, l'apparato di Golgi impacchetta il neuropeptide in piccole vescicole che gemmano da esso. Grazie al flusso assonale le vescicole sono trasportate alle estremità delle terminazioni nervose, pronte per essere liberate nel terminale nervoso all'arrivo di un potenziale d'azione. In genere i neuropeptidi vengono liberati in quantità molto minori rispetto ai neurotrasmettitori a basso peso molecolare, ma ciò è compensato dal fatto che i neuropeptidi sono assai più potenti.

51 Il terminale pre-sinaptico Fig. 6.23, 6.24, 6.25 Colina-Acetil-Transferasi (ChAT) Acetilcolina = Colina + Gruppo acetato (AcetilCoA) Aceticolina inserita nelle vescicole e pronta ad essere rilasciato in modo quantico nello spazio intersinaptico, dopo l arrivo del Ca2+ Trasportatore vescicolare Acetilcolina (VAChT) + pompa vescicolare a protoni

52 Il terminale post-sinaptico Il terminale post-sinaptico si contraddistingue per l assenza delle vescicole, e per la presenza della membrana post-sinaptica, sulla quale sono posti i recettori ionotropi o metabotropi sensibili al neurotrasmettitore che trasformeranno l impulso chimico nuovamente in un impulso elettrico. Nello spazio sottostante la membrana post-sinaptica è presente la densità post-sinaptica, un aggregato di proteine, enzimi etc Quando il ligando apre i canali presenti sul versante postsinaptico si genera il cosi detto potenziale post-sinaptico eccitatorio o inibitorio (PPSE, PPSI).

53 La sommazione spaziale o temporale dei PPSE Fig. 6.26

54 L eliminazione del neurotrasmettitore dallo spazio inter-sinaptico Il corretto funzionamento di una sinapsi chimica, si basa sulla relazione costante tra potenziali d azione in arrivo e quantità di neurotrasmettitore rilasciato nello spazio intersinaptico. Ciò presuppone l esistenza di meccanismi di smaltimento del neurotrasmettitore nello spazio intersinaptico. Tali meccanismi devono essere molto precisi perché è evidente che una eccessiva o una insufficiente rimozione di quest ultimo causerebbe una ipo- o una iper-attivazione della sinapsi. Questi meccanismi di rimozione sono di tre tipi: Degradazione enzimatica (degradato da enzimi posti sulla faccia esterna della membrana post-sinaptica, i.e. acetilcolinesterasi, COMT, sulfotransferasi; poi riportato nella membrana pre-sinaptica da appositi trasportatori) Ricaptazione retrograda (ricaptazione ad opera di uno specifico trasportatore retrogrado, i.e. DAT, NET, SERT. Una volta riportati nel bottone pre-sinaptico possono essere reinseriti nelle vescicole, oppure degradate da un altro enzima denominato monoamminossidasi - MAO) Diffusione extrasinaptica (meccanismo utilizzato per il GABA e per il Glutammato, consiste nella diffusione al di fuori dello spazio intersinaptico, e nella successiva ricaptazione a carico sia dei trasportatori retrogradi che degli astrociti)

55

56 Le sinapsi elettriche Chiamate anche giunzioni gap, consentono il trasferimento veloce e bidirezionale delle informazioni nervose, connettendo due cellule come se fossero un unica cellula, chiamata sincizio metabolico.