CRIOCONSERVAZIONE. La crioconservazione è una branca della criobiologia:

Transcript

1 CRIOCONSERVAZIONE La crioconservazione è una branca della criobiologia: permette di mantenere la vitalità cellulare tramite congelamento, alla temperatura di C in azoto liquido (LN2) per un tempo illimitato, creando uno arresto del metabolismo cellulare. è efficace se la cellula torna vitale dopo averla scongelata : prima nascita di un bambino dopo congelamento e scongelamento embrionale. RAZIONALE Crioconservazione di cellule riproduttive : gameti maschili e femminili (ovociti e spermatozoi) cui segue stoccaggio a-196 C Evita la formazione di ghiaccio intracellulare tramite l uso di Crioprotettori.

2 criobiologia La criobiologia studia: fenomeni fisico chimici che avvengono in una cellula e sulla sua vitalità quando essa è sottoposta a congelamento e a scongelamento (cooling/warming). FASI :Durante la fase di congelamento esiste un equilibrio termico ed osmotico: Il criocongelamento provoca: riduzione delle attività enzimatiche riduzione dei meccanismi di trasporto attivo modificazioni della conformazione della membrana cellulare. il criocongelamento sottozero provoca la formazione di ghiaccio nella soluzione in cui è immersa la cellula con la comparsa causuale di cristalli di ghiaccio. Il primo nucleo di ghiaccio può comparire nel compartimento intracellulare o extracellulare: tale evento danneggia la cellula. Cold shock: Si può avere un danno per mutazioni improvvise di T. al disotto del punto di congelamento. la temperatura di raffreddamento ottimale cambia secondo le dimensioni e il tipo di cellula da trattare; gli ovociti hanno un rapporto superficie /volume basso ;quindi più grandi sono le dimensioni più è difficile la sopravvivenza in quanto maggiore è il tempo di equilibrio per una massa citoplasmatica più grande fase di raffreddamento e il ritorno alle condizioni fisiologiche: durante la fase di raffreddamento occorre operare il seeding ( tra-10 e-8 C) che è la semina del freddo ovvero fa iniziare il congelamento con formazione di un nucleo di ghiaccio nel comparto del medium extracellulare. Disidratazione:si ha la formazione di ghiaccio extracellulare quando si abbassa gradualmente la temperatura dell acqua. l acqua intracellulare subisce un movimento verso l esterno per la cristallizazione nel citoplasma (intorno a-2 C)- con la diminuzione dell acqua intracellulare si ha una concentrazione dei soluti ed aumento extracellulare al difuori della cellula. < 20 C la concentrazione dei soluti nella frazione liquida aumenta di oltre 10 volte.. La concentrazione extracellulare crea una differenza tra l esterno e l interno della cellula: un gradiente osmotico. Il gradiente osmotico fa in modo che l acqua esca con collassamento e raggrinzimento della cellula per disidratazione. H2O soluti H2O

3 CRIOCONSERVAZIONE Durante il raffreddamento di cellule e tessuti si hanno dei danni che possono essere ridotti esponendo le cellule a sostanze come i crioprotettori prima del congelamento e utilizzando basse velocità di raffreddamento. CRIOPROTETTORI : hanno l azione di proteggere la cellula dai danni dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento. sono sostanze ad alta solubilità in acqua ma con una tossicità dannosa per le cellule per l alta concentrazione di lavoro. Importante è la concentrazione di lavoro e la loro rimozione per ripristinare il microambiente intracellulare e lo sviluppo successivo della cellula. Crioprotettori: permeanti :glicerolo, 1-2propandiolo (PROH), dimetilsulfossido (DMSO), Etilen glicole (EG). L acqua intracellulare esce, mentre il crioprotettore entra. non permeanti: saccarosio, polivinilpirrolidone. L acqua esce ma i crioprotettori non entrano nella cellula Meccanismio d azione agiscono sostituendosi all acqua intracellulare evitando la formazione di cristalli di ghiaccio. L azione è di tipo colligativo riducendo la quantità di ghiaccio formatosi dentro la cellula quando essa viene esposta a temperature sotto lo zero. abbassano il punto di congelamento della soluzione e permettono una disidratazione delle cellula durante il congelamento lento. L azione protettiva avviene sulla membrana cellulare con cambiamento dello stato fisico da fluido a parzialmente rigido tramite modificazioni del microambiente intra ed extra cellulare. Quando avviene lo scongelamento, il crioprotettore va rimosso gradualmente per minimizzare lo shock osmotico: alla soluzione di scongelamento si aggiunge il saccarosio (non permeante) che agisce da pompa osmotica.

4 CRIOCONSERVAZIONE: 2 tecniche Congelamento lento (slow cooling): l acqua che esce impedisce la formazione di cristalli di ghiaccio all interno dal citoplasma. Gli ovociti hanno un rapporto tra la superficie /volume che è basso, per questo motivo per avere sufficiente uscita di acqua dalla cellula il congelamento deve essere necessariamente lento. Il congelamento lento è utilizzato per i gameti, gli embrioni e la blastocisti Vitrificazione (fast cooling) :A temperature < 100 C, in presenza dei crioprotettori, il compartimento cellulare entra in uno stato semi-vetroso compatibile con lo stoccaggio a lungo termine di materiale vitale. Il congelamento fast è utilizzato per i gameti, gli embrioni e la blastocisti È Importante modalità di conservazione delle cellule congelate e il loro successivo scongelamento Scongelamento: punti critici :la possibile ricristallizzazione e lo shock osmotico. Ricristallizzazione:l acqua entra nella cellula e si solidifica attorno a nuclei di cristalli di ghiaccio che si erano formati precedentemente ingrandendoli. Tale fenomeno deve essere evitato con una disidratazione e un rapido scongelamento della cellula. Se il crioprotettore,che era entrato nella cellula durante il processo di congelamento, non può uscire fuori abbastanza velocemente da prevenire l ingresso dell acqua e lo swelling della cellula stessa allora può avvenire uno shock osmotico.

5 CELLULE PER LA CRIOCONSERVAZIONE Spermatozoi e tessuto tesiticolare Ovociti e tessuto ovarico Zigoti embrioni pre compattazione Blastocisti CRIOCONSERVAZIONE.

6 CRIOCONSERVAZIONE EMBRIONI slow cooling LA CRIOCONSERVAZION E DEGLI EMBRIONI Indicazioni per la tecnica: Produzione di embrioni soprannumerari: crioconservazione nei casi previsti dalle deroghe alla legge 40/2004) e possibilità di effettuare transfer embrionali, in un successivo ciclo di trattamento o transfer di embrioni in un ciclo spontaneo; Rischio di iperstimolazione per la partner TECNICHE DI CONGELAMENTO DEGLI EMBRIONI Congelamento lento: slow cooling Vitrificazione (Congelamento ultra rapido) : fast cooling Congelamento lento Avviene attraverso una progressiva disidratazione delle cellule si evita la formazione di ghiaccio intracellulare. Si ha una diminuzione lenta e controllata della temperatura fino a C tramite un criocongelatore programmabile, in grado di creare una curva di discesa della temperatura controllata, collegato ad una pompa per l alimentazione con LN2. Si inseriscono le curve di discesa della temperatura di congelamento da utilizzare nella memoria del computer I crioprotettori : l 1-2 propandiolo (PrOH) e il saccarosio; porre gli embrioni da congelare in Sol.1 PBS addizionato con albumina ricombinante) x 5 ; poi in Sol.2 (1.5M di 1,2 PrOH in sol.1) x 10 poi in Sol.3 (1.5M di 1,2 PrOH+ 0.1M saccarosio in sol.1) e quindi caricamento delle paillettes (massimo tre embrioni/paillette) Il processo avviene con l ausilio di congelatore programmabile con il quale è possibile impostare una curva di congelamento. Curva di discesa della temperatura Start : Temperatura ambiente( t.a). Discesa fino a 7 C alla velocità di- 2 C al minuto SEEDING (semina del ghiaccio) è una somministrazione addizionale di freddo che induce la formazione di ghiaccio nel medium extracellulare.consiste nel toccare con una pinza raffreddata in azoto liquido la paillettes vicino all estremità (lontano cioè dalla zona contenente gli embrioni) fino a che non si osserva la formazione di ghiaccio nel punto di contatto tra paillette e pinza e avviene quando la temperatura della soluzione è uno o due gradi superiore al punto di congelamento(-7 C); Temperatura stabile a 7 C per 10 Discesa fino a 30 C alla velocità di C al minuto Rapida discesa fino a 110 C Immersione in azoto liquido

7 CRIOCONSERVAZIONE EMBRIONI: fast cooling -vitrificazione Vitrificazione (Congelamento ultra rapido) E un processo di congelamento di cellule e tessuti senza la formazione di ghiaccio intracellulare che solidificazione del liquido non per cristallizzazione ma tramite il raggiungimento di un elevata viscosità durante il raffreddamento. porta alla trasformazione della cellula in uno stato solido simile al vetro attraverso un rapido congelamento che previene la formazione di cristalli di ghiaccio migliorando la vitalità cellulare. Il liquido solidifica al di sotto del punto di congelamento senza passare attraverso la fase cristallina. L acqua non ha il tempo di formare cristalli di ghiaccio, grazie alla viscosità cellulare ottenuta con l aggiunta di alte concentrazioni di crioprotettivi e alla rapida discesa della temperatura. avviene utilizzando una soluzione acquosa di crioprotettore che ha una elevata concentrazione viscosa di modo di passare direttamente dallo stato liquido allo stato solido. Lo stadio dell embrione più idoneo per il congelamento è quello a 2-4 cellule. l embrione vitrifica tra 25 C e -45 C, subito dopo dopo viene immerso in azoto liquido medicale (LN2) Lo scongelamento deve essere rapido evitando il passaggio da vitrificazione a cristallizzazione. La qualità degli embrioni post scongelamento si basa sulla verifica dell integrità dei blastomeri e dell attività mitotica) La vitrificazione è un alternativa alla crioconservazione di ovociti con la tecnica del congelamento lento; si può controllare la modificazione della cellula ad ogni processo e si minimizzano i tempi di esposizione dei gameti ad una condizione non fisiologica. La tecnica richiede pochi minuti invece dei tempi più lunghi per il congelamento con il metodo lento che viene eseguito da un apparecchio automatizzato. Crioprotettore utilizzato: Dimetilsulfossido (DMSO) ma è più utilizzato il PrOH con saccarosio; La vitrificazione : Non prevede l uso di congelatori biologici Prevede una velocità di raffreddamento maggiore e l utilizzo di concentrazioni più alte di crioprotettore

8 CRIOCONSERVAZIONE: liquido seminale CRIOCONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE Si effettua per: autoconservazione in caso di patologie neoplastiche per mantenere la fertilità futura; in caso di difficoltà di raccolta nel giorno del pick-up. per la donazione (vietata in Italia) MATERIALI E STRUMENTI Crioprotettori (tuorlo d uovo, glicerolo, citrato di sodio, fruttosio) Medium: TEST Yolk Buffer freezing medium; medium con glicerolo e fruttosio Azoto liquido medicale(ln2) Paillette di volume 0,25-0,5 ml (con tappini ad una estremità, l altra va sigillata a caldo dopo il riempimento) Visotubi di vari colori Siringa da 10 ml con dispositivo flessibile di collegamento alla paillette Materiale sigillante in P.V.C. Contenitori di stoccaggio e di congelamento Preparazione delle paillettes e congelamento Dopo liquefazione del campione, si effettua un esame per determinare il numero, la motilità e la morfologia nemaspermica. Inoltre si calcola il Total motily count (TMC) che indica il numero totale di spermatozoi mobili progressivi. Il campione viene diluito 1 a 2 a temperatura ambiente (t.a.) con il crioprotettore. Con la miscela preparata si riempiono le paillettes. Si sigilla la parte estreme delle paillette a caldo con un apposito apparecchio. Le paillettes vengono, poi, immerse in acqua distillata per 15 a t. a. Si approntano dei visotubi dove saranno alloggiate le paillettes (riportando sulle paillette i dati anagrafici,la data di preparazione, e un codice identificativo di sicurezza) I viso tubi a loro volta vengono sistemazione all interno dei canestri di stoccaggio in acciaio. Le paillette sistemate all interno dei canister sono esposti ai vapori di LN2 per circa 15 senza immersione che avviene delicatamente allo scadere del tempo.

9 Criocongelamento nemaspermi procedura che prevede un apparecchio automatico di criocongelamento secondo un protocollo. Preparazione delle paillettes e congelamento Dopo liquefazione del campione, si effettua un esame per determinare il numero, la motilità e la morfologia nemaspermica. Inoltre si calcola il Total motily count (TMC) che indica il numero totale di spermatozoi mobili progressivi. entro +/- 10% rispetto alla metà della concentrazione nemaspermatica iniziale. Il campione viene diluito 1 a 2 a temperatura ambiente (t.a.) con il crioprotettore. Con la miscela preparata si riempiono le paillettes. Si sigilla la parte estreme delle paillette a caldo con un apposito apparecchio. Le paillettes vengono, poi, immerse in acqua distillata per 15 a t. a. Si approntano dei visotubi dove saranno alloggiate le paillettes (riportando sulle paillette i dati anagrafici,la data di preparazione, e un codice identificativo di sicurezza) I viso tubi a loro volta vengono sistemazione all interno dei canestri di stoccaggio in acciaio. Le paillette sistemate all interno dei canister sono esposti ai vapori di LN2 per circa 1 senza immersione che avviene delicatamente allo scadere del tempo. Può essere usata anche una procedura che prevede un apparecchio automatico di criocongelamento secondo un protocollo. Procedura di scongelamento Le paillettes sono trasferite da 196 C a t. ambiente per 10, poi vengono immerse in un bagno a 37 C per altri 10 ; Si taglia una delle due estremità sigillate della pailletta in modo che Il campione esce per gravità. Dopo l allontanamento del crioprotettore, si effettua la tecniche di capacitazione più appropriate per la procedura PMA in esecuzione (ICSI,IUI,FIV) Fattore di criospermia= (% spz mobili dopo scongelamento/%spz monili prima dello scongelamento ) x 100 CSF accettabile > 50% Controllo di qualitàla concentrazione nemaspermica delcampione dopo lo scongelamento deve variare entro +/- 10% rispetto alla metà della concentrazione nemaspermatica iniziale.

10 CRIOCONSERVAZIONE DEGLI OVOCITI Dal 1986 :inizio tecnica di congelamento di ovociti Indicazione alla tecnica: Produzione di un numero alto di ovociti. Preservazione nelle pazienti con neoplasie che si devono sottoporre a trattamenti chemioradioterapici e che desiderano conservare una fertilità dopo la remissione o la guarigione della malattia. Attualmente: La crioconservazione di fettine di ovaio e di ovociti immaturi permette di conservare la fertilità in pazienti giovani malate di neoplasie che devono effettuare terapie antineoplastiche gonotossiche ma, che desiderano conservare la fertilità in attesa della guarigione. per conservare la fertilità in donne con menopausa precoce, endometriosi. Superamento dei problemi di natura etico-legale legati al congelamento embrionario. Social freezing: Conservare nel tempo il potenziale dei gameti procrastinando la scelta della maternità. Ausilio per le pazienti in cui i cicli di stimolazione siano a rischio di cancellazione per l indisponibilità improvvisa del campione seminale. Note La crioconservazione degli ovociti ha maggiori difficoltà tecnica di quella per i gameti maschili e gli embrioni, a causa delle dimensioni dell ovocita l ovocita ha un contenuto di acqua maggiore di altre cellule come la blastocisti o l embrione. Le cellule di grosse dimensioni hanno un basso rapporto superficie/volume, per cui si dimostrano meno efficienti nei confronti della permeabilità al crioprotettore e nella disidratazione: è più facile causare uno stress osmotico e più difficile evitare la formazione di ghiaccio intracellulare la permeabilità dell ovocita all acqua e ai soluti risulta determinante per il successo del protocollo di congelamento. Importante inoltre è la qualità e l età ovocitaria: per essere crioconservato l ovocita deve trovarsi nello stadio maturativo: MII Nel caso della criopreservazione dell embrione l acqua attraversa la membrana più rapidamente del crioprotettore e si ha raggrinzimento dei blastomeri che ritorneranno normali dopo raggiungimento dell equilibrio osmotico; per l ovocita al fine di evitare un improvvisa deformazione che danneggi le strutture citoplasmatiche, si aggiunge a temperatura ambiente il crioprotettore a tappe successive. TECNICHE DI CONGELAMENTO DEGLI OVOCITI Congelamento lento: slow cooling Vitrificazione (Congelamento ultra rapido) fast cooling Il tipo di crioprotettore da utilizzare:propandiolo e saccarosio; DMSO

11 CRIOCONSERVAZIONE DEGLI OVOCITI: congelamento lento Gli ovociti devono essere congelati tra le 38 e le 40 ore dopo la somministrazione di hcg e comunque entro 8 ore dalla raccolta. Gli ovociti vengono congelati decumulati per l osservazione dello stadio maturativo MII La rimozione del cumulo ooforo favorisce la penetrazione dei crioprotettori nel citoplasma cellulare aumentando la sopravvivenza. si usa la ICSI per inseminare gli ovociti scongelati, invece della FIV convenzionale per evitare fallimenti della fecondazione causata dal rilascio prematuro dei granuli corticali e loro riduzione dei granuli che può causare una zona hardening non fisiologica degli ovociti con aumento di incidenza di poliploidia e Effetti della crioconservazione: Nell ovocita maturo i cromosomi sono disposti sulle fibre del fuso meiotico la cui struttura è importante durante la fecondazione per il corretto allineamento, segregazione e distribuzione dei cromosomi dopo la fecondazione. Il fuso è estremamente sensibile al raffreddamento con depolimerizzazione delle fibre, La depolimerizzazione è reversibile quando gli ovociti ritornano a 37 C il danno è irreversibile dopo un esposizione a temperatura ambiente per Dopo 1 min. a 0 C il danno del fuso non è influente Dopo 10 il fuso scompare completamente. La depolimerizzazione a 0 C, non provoca una dispersione dei cromosomi: imicrotubuli uniti ai cinetocori sono più resitenti al raffreddamento rispetto ai microtubuli incrociano i cromosomi attraverso la piastra metafasica; Il fuso microtubulare è sensibile all esposizione ai crioprotettori. Gli ovociti esposti a propandiolo, in presenza e in assenza di congelamento, non presentano perdita di cromosomi nonostante l assenza o l anormalità del fuso.

12 VITRIFICAZIONE: ovociti VITRIFICAZIONE: si utilizzano alte concentrazioni di crioprotettore (superiore a 8.0 mol/l) e un congelamento e scongelamento rapido per evitare la formazione di ghiaccio nel citoplasma delll ovocita. La vitrificazione è molto rapida : in meno di 1 minuto gli ovociti devono essere messi nella soluzione di vitrificazione, caricati in appositi supporti e immersi in azoto liquido. Più veloce è il processo, maggiori sono le possibilità di successo. I supporti per la vitrificazione per minimizzare il volume della soluzione e quindi per velocizzare il raffreddamento della cellula sono: aperti (Open carriers): L open carrier mette in contatto l ovocita con l azoto liquido (non sterile) con possibile rischio di contaminazione da batteri, funghi, virus, metalli pesanti. (Si può usare un sistema di sterilizzazione di azoto). Cryoleaf (la velocità di raffreddamento della cellula può arrivare fino a C/min) Open Pulled Straw (OPS) Cryoloop (nylon loop) Hemi-Straw Cryotop Cryolock Vitri-inga Plastic-blade Rapid-I, Ultravit Supporti di vitrificazione chiusi (Closed carriers): Il modello straw-in-straw, isola il carrier interno con le cellule dal LN 2 attraverso una straw (tubicino) esterno le cellule sano protette dal contatto diretto con l'azoto liquido e quindi dalla possibile contaminazione. Le velocità di raffreddamento sono minori rispetto ai sistemi aperti con conseguente necessità di aumentare la concentrazione del crioprotettore (maggiormente tossico per gli ovociti) I closed carriers si usano per vitrificare zigoti, embrioni, blastocisti e tessuto ovarico: non sono consigliabili per gli ovociti perchè determinano una riduzione nella velocità di cooling/warming (raffreddamento/ riscaldamento) Esistono,però, single-straw closed systems che permettono un cooling più rapido : CryoTip Cryotop Cryopette

13 Vitrification Open pulled straw system (OPS) Contatto diretto tra crioprotettante con gli ovociti e l LN2 Closed pulled straw system (CPS) Tra il crioprotettante con gli ovociti e l LN2 vi è una interfacie di

14 CRIOCONSERVAZIONE di TESSUTO OVARICO e di OVOCITI da tessuto ovarico: IN VITRO CRIOCONSERVAZIONE DEGLI OVOCITI Ovociti in metafase II (maturi) Ovociti immaturi (VG) Un alternativa alla conservazione di ovociti maturi è il congelamento di ovociti in profase I (VG Vescicola germinativa e la crioconservazione di sezioni di tessuto ovarico con follicoli primordiali a cui segue la maturazione in vitro degli ovociti in essi contenuti( IVM in vitro maturation) e la successiva fecondazione. Ovociti immaturi del tessuto ovarico : l tessuto ovarico è una matrice complessa di follicoli a vari stadi maturativi in cui vi sono ovociti a vari stadi di sviluppo, circondati da cellule tecali e cellule della granulosa. Il congelamento del tessuto deve conservare a vitalità di queste cellule in modo da consentire la ripresa dello sviluppo dopo scongelamento ed eventuale impianto come tessuto reinnestato. Procedura Coltura dei follicoli Crescita in vitro Maturazione in vitro coltura per maturazione in vitro di follicoli immaturi isolati dal tessuto ovarico con produzione di ovociti maturi in grado di essere fecondati. Riproduzione assistita: IVF-ICSI, Embryo transfer e hatching assistito Crioconservazione di tessuto ovarico per trapianto: Conservazione fertilità in pazienti oncologiche. Crioconservazione del tessuto ovarico e successivo autotrapianto Il protocollo di congelamento si effettua trattando le sezioni di tessuto corticale con 1-2 Propandiolo in combinazione con saccarosio (0.1M) per 90 a temp. ambiente e congelamento lento. CRIOCONSERVAZIONE DEL TESSUTO OVARICO con Trapianto Trapianto ortotopico: si ha il recupero della funzione riproduttiva e la conservazione della fertilità naturale e la possibilità di concepimento Trapianto eterotopico : si effettua tramite autoinnesti o xeno innesti con recupero di ovociti.

15 Congelamento di Blastocisti Congelamento di Blastocisti : Si ha un danno minore in quanto vi sono molte cellule nella blastocisti e una riduzione e semplificazione del carico di lavoro. Equilibrium cooling: congelamento lento Non equilibrium cooling : vitrificazione CPA Velocità : -1 C/min Disidratazione durante il congelamento *formazione ghiaccio intracellulare(da evitare) CPA Velocità : C/min Disidratazione prima del congelamento *minima formazione ghiaccio intracellulare Scongelamento Lo scongelamento è rapido e a temperatura ambiente Metodo: porre gli embrioni da scongelare in Sol 1( 1.5 M di PrOH M saccarosio in PBS) x 5 poi in Sol.2(1.5 M di PrOH M saccarosio in PBS) x 10 quindi in Sol.3(1.5 M di PrOH in PBS x 10 ) infine in Sol.4(PBS x 5 ) Le blastocisti vengono quindi trasferiti in terreno di coltura e posti in incubatore.

16 Congelamento Gli ovociti sono caricati per via capillare, dalla parte terminale delle paillette in una goccia di medium di raffreddamento mediante immersione diretta in azoto liquido medicale (LN2) Sistema open pulled straw Scongelamento la pailletta viene immersa nel medium. Il medium di vitrificazione diventa liquido e viene immediatamente diluito dal medium holding che entra nella pailletta. Gli ovociti escono fuori dalla pailletta per sedimentazione nel disco di coltura. LN2 Embrioni nel crioprotettore Embrioni nel medium scongelamento

17 SISTEMA Closed pulled straw Il sistema di CPS migliora le percentuali di sopravvivenza degli ovociti e preserva lo spindle (specialmente in ovociti GV criocongelati) La punta della pailletta è caricata con 2mm di medium di vetrificazione, 2mm di aria 2mm di medium, 2mm di aria e 2mm di medium Dopo si immerge la pipetta in LN2 per la vitrificazione diretta. Scongelamento: i CPS vengono prelevati da LN2 ed il contenuto è espulso in un Soluzione di 0.5mol /L di saccarosio.