VALUTAZIONE DI UNA DOSE DI VITAMINA KTRAMITE INDAGINE NANODIAGNOSTICA DI MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE E MICROANALISI A RAGGI X
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1 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 1 di 39 RAPPORTO N 01/2018 VALUTAZIONE DI UNA DOSE DI VITAMINA KTRAMITE INDAGINE NANODIAGNOSTICA DI MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE E MICROANALISI A RAGGI X Committente : sig. Mida Riva - VacciniPuliti.it Materiale in esame : Vitamina K iniettabile - Konakion Responsabile: dott.ssa Antonietta Gatti Firma: Data: 30 gennaio 2018 Il presente rapporto si compone di 39 (trentanove) pagine eccetto la copertina. Nota: I risultati sono da riferirsi solo al materiale esaminato e per il tipo di applicazione richiesta. In caso di riproduzione del presente documento, il Committente s impegna a farlo solo in modo integrale. Un eventuale riproduzione parziale deve essere autorizzata per iscritto da Nanodiagnostics srl.
2 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 2 di 39 INDICE 1. Introduzione Materiali Tipi di analisi eseguite Preparazione dei campioni Risultati... 7 Reperto 1. Konakion prima infanzia 2mg/0,2 ml lotto: F2240F04 scadenza 04/ Conclusioni Commenti Riferimenti bibliografici... 39
3 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 3 di Introduzione Nanodiagnostics srl è un azienda di consulenze scientifiche nei settori della nanotecnologia, della medicina, dell industria specie farmaceutica e alimentare, dell ambiente e dell ecologia. L attività principale di nanodiagnostica consta nel rilevamento di micro- e nanoparticelle inorganiche (con diametro sotto al micron) in qualsiasi mezzo (tessuti biologici, alimenti, farmaci, cosmetici, campioni ambientali, ecc.) tramite una tecnica innovativa di microscopia elettronica ambientale. L indagine si avvale principalmente di un FEG-ESEM (Field Emission Gun - Environmental Scanning Electron Microscope, 200, Quanta, FEI Company, Olanda), cioè un microscopio elettronico a scansione ambientale a emissione di campo, opportunamente adattato allo scopo. Le analisi morfologiche e composizionali possono essere eseguite su ogni matrice anche contenenti oli, in condizioni di normale idratazione (wet mode) e a pressione atmosferica. In generale, quindi non vi è la necessità di processare i campioni per disidratarli e di renderli elettroconduttivi. Processo questo indispensabile con i normali microscopi elettronici che lavorano ad alto vuoto. La elettroconduttività si realizza tramite una ricopertura del campione di carbone oppure di metalli quali l oro e il palladio. Applicando protocolli da adattare ad ogni tipo di osservazione, la metodica sviluppata consente di esaminare campioni biologici, comprese cellule vive, senza intaccarne l integrità, e di ripetere l osservazione ogni volta lo si desideri. Il principale obiettivo dell indagine, l individuazione di micro- e nanoparticolato inorganico eventualmente contenuto nell esemplare in studio, viene quindi raggiunto senza alcun processamento del campione. Ognuno dei preparati viene osservato in tutta la sua estensione sotto il microscopio, a seconda del campione, in diverse modalità: SED (elettroni secondari) e BSE (elettroni retrodiffusi), in basso vuoto (circa 0,98 Torr), a KV e con spot vari (da 6 a 4) a seconda dell ingrandimento ad una distanza di 10 mm. Sul particolato identificato si punta la sonda microanalitica a raggi X per determinarne la composizione chimica. Una microanalisi a raggi X a dispersione d energia (EDS, cioè Energy Dispersive Spectroscopy, EDAX, USA), misurando l energia caratteristica che i vari elementi costituenti il campione restituiscono sotto forma di radiazioni X dopo essere stati colpiti dal fascio elettronico emesso dalla sorgente, fornisce la composizione chimica elementare del
4 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 4 di 39 particolato rinvenuto. Ogni reperto viene debitamente fotografato ed archiviato insieme con lo spettro degli elementi individuati. L analisi non è distruttiva ed è ripetibile, con la sola eccezione dei fluidi, spesso impossibili da recuperare. Essendo l oggetto principale dell indagine di natura inorganica non biodegradabile, non ci sono difficoltà nell individuare particolato del genere sia in campioni freschi sia in campioni d archivio. Nel caso in esame di un farmaco contenente vitamina K si è deciso di depositare gocce di farmaco su un filtro di cellulosa, che, dopo evaporazione, si è osservato al microscopio elettronico.
5 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 5 di Materiali E stata acquistata dal Laboratorio una confezione integra di Konakion prima infanzia 2mg/0,2 ml soluzione orale e iniettabile fitomenadione (vitamina K ¹ ) sintetica della ditta Roche S.p.A lotto: F2240F04 scadenza 04/2020. La confezione contiene5 fiale da 0,2 ml con siringa per somministrazione orale. Medicinale commercializzato in Italia.
6 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 6 di 39 Il campione è stato ricodificato presso il nostro laboratorio come STD Tipi di analisi eseguite Lo studio del reperto in esame ha verificato l eventuale presenza di corpi estranei nel farmaco, mediante tecnica di microscopia elettronica a scansione ambientale (FEG ESEM Quanta 200, FEI), mentre la microanalisi a raggi X (EDS, EDAX,USA) ha valutato la composizione chimica dei corpi estranei eventualmente identificati, come descritto al paragrafo 1. Nessun processamento è stato eseguito sulla sezione del reperto che è stato, quindi, esaminato dopo deposito su filtro. La metodica, risultato del progetto comunitario europeo QLRT (Nanopathology), permette di valutare anche la presenza di particelle di dimensioni nanometriche (vedi riferimenti bibliografici 1-2). 4. Preparazione dei campioni Presso il laboratorio Nanodiagnostics la confezione di Vitamina è stata conservata in frigorifero fino alla procedura di allestimento. Prima della preparazione è stata ulteriormente verificata l integrità della confezione. Successivamente la confezione è stata aperta da personale idoneo all interno di una cappa a flusso laminare. Il reperto è stato agitato orizzontalmente per 1 minuto al fine di rendere la soluzione omogenea all interno della confezione che poi è stata aperta e con una siringa per insulina sterile si sono prelevati circa 40 microlitri. Questi sono poi stati depositati su un filtro di nitrocellulosa (MIllipore, AWG 0.45 micron) montato a sua volta su un disco di Carbonio adeso ad un supporto d Alluminio per l osservazione di microscopia elettronica. Il campione così preparato è stato posto in adeguato contenitore pulito, chiuso,e lasciato asciugare a temperatura ambiente sempre all interno della cappa a flusso laminare nel contenitore chiuso. Nello stesso tempo si è preparato, sempre all interno della cappa, un identico supporto (filtro di nitrocellulosa + disco di carbone su stub di Alluminio) su cui non è stato depositato niente. Il campione serve come riferimento e controllo per eventuali contaminazioni all interno della cappa a flusso laminare usata per la preparativa. Dopo circa 24 ore si è proceduto all analisi al microscopio elettronico senza nessun ulteriore trattamento.
7 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 7 di 39 Tutte le procedure di allestimento sono state eseguite in ambiente protetto da inquinamento ambientale e condotte con strumenti puliti. Il campione è stato riaperto solo quando la cameretta del microscopio è stata aperta. L inserimento è stato immediato. Si è poi proceduto a realizzare un vuoto all interno della cameretta così da aspirare ogni altra possibile polvere. 5. Risultati Le analisi di microscopia elettronica hanno messo in evidenza la presenza nel campione di rari corpi estranei con composizione chimica diversa (vedi Tabelle). I risultati morfologici e chimici del campione sono mostrati nelle immagini successive. I picchi dello spettro che non riportano indicazioni dell elemento a cui si riferiscono sono picchi secondari di un elemento già segnalato in coincidenza del picco principale. Nota: l elenco degli elementi nelle tabelle osserva il criterio di maggior rappresentatività dell elemento nello spettro EDS. La successione degli elementi inizia da quelli con il picco EDS più alto.
8 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 8 di 39 Reperto 1. Konakion prima infanzia 2mg/0,2 ml lotto: F2240F04 scadenza 04/2020 La tabella riassume tutte le analisi più significative eseguite sul campione. Tabella I. Analisi EDS del reperto 1. N. analisi Descrizione Elementi presenti 1 detrito da 10 µm xx Fe O C Ti Al Mg Mn P 2 detrito da 30 µm x Si O C Al Na Ti P K Ca Fe 3 detrito da 80 µm x C O Al Si P Na C O P Na 4 agglomerato da 100 µm X Ca C O Al Si P Na 5 agglomerato da 250 µm - 700x Ca O C Al Si P Mg 6 cluster da 50 µm x Ca C O Al Si P Mg 7 detriti da 18 µm e 50 µm x Fe Cr Ni C O Si P C O P Si Na 8 detrito da 50 µm x Si O C Al Ti Na K Ca Fe 9 detrito da 18 µm x Si O C Na Ca Mg Al K 10 agglomerato da 18 µm x Ca C O Mg Al Si Na P 11 agglomerato da 30 µm x O Al Si O Na P 12 detriti da 10 µm e 40 µm x Si O C C O Na P Si 13 detrito da 40 µm x Al Cu C O 14 detrito da 11 µm x Al Cu C O 15 detrito da 10 µm x Si O Mg C Fe 16 detrito da 15 µm x Si O Mg C Fe P Na 17 detrito da 20 µm x C O P Na 18 detrito da 30 µm x Ca C O Si Al Na Mg P 19 detrito da 7 µm x C Si O Al Na P Ti K x immagine morfologica 21 detrito da 8 µm x Si O C Na Al K Ti Fe 22 detrito da 20 µm x Si O Mg C Fe P Na 23 agglomerato da 125 µm x Ca C O Si Al Na Mg P 24 detrito da 40 µm x Si O C Na Al Ti K Ca 25 detriti da 8 µm e 100 µm - 800x Si O Mg C Fe P Na Si O C Na Al Ti K Ca 26 cluster da 25 µm x C O Ca Si Al Na P 27 detrito da µm x Si C O Na P 28 aggregato da 50 µm x C O Si Ca Al Fe Mg Na P Cl 29 aggregato da 10 µm x Ca C O Si Al Na Mg P
9 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 9 di 39 Analisi 1 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (2.585x) in cui è visibile un detrito da 10 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Ferro,Ossigeno,Carbonio,Titanio,Alluminio,Magnesio,Manganese, Fosforo.
10 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 10 di 39 Analisi 2 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (1.911x) in cui è visibile un detrito da 30 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Ossigeno, Carbonio, Alluminio, Sodio, Titanio, Fosforo, Potassio, Calcio, Ferro.
11 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 11 di 39 A A B Analisi 3 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (3.011x) in cui è visibile un detrito da 80 micron. Le analisi EDS mostrano che il detrito è composto da Carbonio, Ossigeno, Alluminio, Silicio, Fosforo, Sodio (Fig. A) mentre il substrato (parte biologica)è composto da Carbonio, Ossigeno, Fosforo, Sodio (Fig. B). Questo segnale (Standard) della vitamina dopo evaporazione è importante perché caratterizza altre polveri intrappolate nel campione durante la sua produzione industriale.
12 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 12 di 39 Analisi 4 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (1.500x) in cui è visibile un aggregato da 100 micron che contiene altri corpi estranei. L analisi EDS mostra che esso è composto da Calcio, Carbonio, Ossigeno, Alluminio, Silicio, Fosforo, Sodio.
13 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 13 di 39 Analisi 5 della tabella. La figura mostra una zona del campione a medio ingrandimento (700x) in cui è visibile un aggregato da 250 micron, simile al precedente. L analisi EDS dei corpuscoli mostra che esso è composto da Calcio, Ossigeno, Carbonio, Alluminio, Silicio, Fosforo, Magnesio.
14 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 14 di 39 Analisi 6 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (2.127x) in cui è visibile un agglomerato da 50 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Calcio, Carbonio, Ossigeno, Alluminio, Silicio, Fosforo, Magnesio.
15 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 15 di 39 B A A B Analisi 7 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (2.567x) in cui sono visibili due detriti: uno più luminoso (a destra) da 10 micron e un detrito 40 micron. Le analisi EDS mostrano che il detrito luminoso è composto da Ferro, Cromo, Nichel, Carbonio, Ossigeno, Silicio, Fosforo, cioè acciaio (Fig. A) mentre il secondo detrito è composto da Carbonio, Ossigeno, Fosforo, Silicio, Sodio (Fig. B).
16 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 16 di 39 Analisi 8 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (1.801x) in cui è visibile un detrito acuminato da 50 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Ossigeno, Carbonio, Alluminio, Titanio, Sodio, Potassio, Calcio, Ferro. E una scaglia di vetro.
17 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 17 di 39 Analisi 9 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (4.213x) in cui è visibile un detrito da 18 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Ossigeno, Carbonio, Sodio, Calcio, Magnesio, Alluminio, Potassio.
18 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 18 di 39 Analisi 10 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (8.354x) in cui è visibile un aggregato organico/inorganico da 18 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Calcio, Carbonio, Ossigeno, Magnesio, Alluminio, Silicio, Sodio, Fosforo.
19 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 19 di 39 Analisi 11 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (7.718x) in cui è visibile un aggregato da 30 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Ossigeno, Alluminio, Silicio, Ossigeno, Sodio, Fosforo.
20 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 20 di 39 B A A B Analisi 12 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (5.831x) in cui sono visibili un aggregato da 40 micron (silice) e un detrito da 10 micron. Le analisi EDS mostrano che il detrito è composto da Silicio, Ossigeno, Carbonio (Fig. A) mentre l aggregato è composto da Carbonio, Ossigeno, Sodio, Fosforo, Silicio (Fig. B).
21 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 21 di 39 Analisi 13 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (2.660x) in cui è visibile un detrito da 40 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Alluminio, Rame, Carbonio, Ossigeno.
22 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 22 di 39 Analisi 14 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (9.599x) in cui è visibile un detrito da 11 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Alluminio, Rame, Carbonio, Ossigeno.
23 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 23 di 39 Analisi 15 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (6.429x) in cui è visibile un detrito da 10 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Ossigeno, Magnesio, Carbonio, Ferro. Potrebbe trattarsi di Talco.
24 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 24 di 39 Analisi 16 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (9.644x) in cui è visibile un detrito da 15 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Ossigeno, Magnesio, Carbonio, Ferro, Fosforo, Sodio. Ancora Talco.
25 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 25 di 39 Analisi 17 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (4.071x) in cui è visibile un detrito organico da 20 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Carbonio, Ossigeno, Fosforo, Sodio.
26 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 26 di 39 Analisi 18 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (4.471x) in cui è visibile un detrito a forma di scheggia da 30 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Calcio, Carbonio, Ossigeno, Silicio, Alluminio, Sodio, Magnesio, Fosforo
27 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 27 di 39. Analisi 19 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (17.986x) in cui è visibile un detrito da 7 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Carbonio, Silicio, Ossigeno, Alluminio, Sodio, Fosforo, Titanio, Potassio. Trattasi di polvere.
28 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 28 di 39 Analisi 20 della tabella. La figura mostra una zona del campione a basso ingrandimento (308x).
29 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 29 di 39 Analisi 21 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (3.098x) in cui è visibile un detrito da 8 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Ossigeno, Carbonio, Sodio, Alluminio, Potassio, Titanio, Ferro.
30 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 30 di 39 Analisi 22 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (3.591x) in cui è visibile un detrito da 20 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Ossigeno, Magnesio, Carbonio, Ferro, Fosforo, Sodio. Forse si tratta di talco.
31 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 31 di 39 Analisi 23 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (1.545x) in cui è visibile un aggregato da 125 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Calcio, Carbonio, Ossigeno, Silicio, Alluminio, Sodio, Magnesio, Fosforo.
32 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 32 di 39 Analisi 24 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (4.037x) in cui è visibile un detrito da 40 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Ossigeno, Carbonio, Sodio, Alluminio, Titanio, Potassio, Calcio.
33 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 33 di 39 A B A B Analisi 25 della tabella. La figura mostra una zona del campione a medio ingrandimento (800x) in cui sono visibili un detrito da 8 micron e un detrito da 100 micron. Le analisi EDS mostrano che il primo detrito è composto da Silicio, Ossigeno, Magnesio, Carbonio, Ferro, Fosforo, Sodio (Fig. A) mentre il secondo detrito è composto da Silicio, Ossigeno, Carbonio, Sodio, Alluminio, Titanio, Potassio, Calcio (Fig. B).
34 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 34 di 39 Analisi 26 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (7.330x) in cui è visibile un aggregato da 25 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Carbonio, Ossigeno, Calcio, Silicio, Alluminio, Sodio, Fosforo.
35 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 35 di 39 Analisi 27 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (8.840x) in cui è visibile un detrito da 5 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Silicio, Carbonio, Ossigeno, Sodio, Fosforo.
36 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 36 di 39 Analisi 28 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (2.068x) in cui è visibile un aggregato organico/inorganico da 50 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Carbonio, Ossigeno, Silicio, Calcio, Alluminio, Ferro, Magnesio, Sodio, Fosforo, Cloro.
37 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 37 di 39 Analisi 29 della tabella. La figura mostra una zona del campione ad alto ingrandimento (7.246x) in cui è visibile un aggregato da 10 micron. L analisi EDS mostra che esso è composto da Calcio, Carbonio, Ossigeno, Silicio, Alluminio, Sodio, Magnesio, Fosforo.
38 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 38 di Conclusioni Nel campione di farmaco a base di vitamina K esaminato sono stati identificati alcuni corpi estranei che sembrano contaminazioni industriali introdotte forse durante la fase di produzione o confezionamento. Durante l analisi dei risultati si è prima osservato il campione di controllo che era presente sotto cappa durante la preparazione del campione di farmaco. In quello sono state osservate solo 3 particelle a base di Silicio o Calcio-Silicio, vale a dire normale polvere ambientale. Quindi questa tipologia di particelle, se individuata nel campione del farmaco in esame, è stata scorporata. Un altro parametro importante tenuto in considerazione è lo spettro di analisi n. 3 chiamato standard. Questo identifica la composizione base del farmaco dopo evaporazione, contenente Carbonio, Ossigeno Sodio e Fosforo. Pertanto tutti gli spettri che contengono questi elementi sono da considerarsi come parte integrante della formulazione. Alcuni, peraltro rari, corpi estranei sono stati identificati nel campione di farmaco. In particolare si sono identificati detriti singoli ed aggregati di - Ferro, Cromo e Nichel, cioè acciaio (Analisi n.7) - Ferro con il Titanio insieme con altri elementi riportati i tabella (Analisi n. 1) - Alluminio-Rame (Analisi n ) - Calcio- Silicio (Analisi n. 4, 5, 6, 10, 18, 26, 29) - Silicio-Magnesio, cioè, verosimilmente, talco (Analisi n. 15, 16, 22, 25) Particolare è il detrito dall apparenza spugnosa composto da Ossigeno, Alluminio, Silicio, Sodio e Fosforo (Analisi n. 11). Sono da notare gli aggregati di Analisi n. 4, 5, 6, 10, 11. Pur con la vasta esperienza di nanopatologie non si è in grado di valutare il livello di rischio di ciò che si è identificato.
39 Sede legale: Strada Contrada 309, Modena Pag 39 di 39 Commenti Il campione esaminato contiene alcuni corpi estranei, e questo in misura apparentemente molto inferiore a quella rilevata in altri farmaci iniettabili. Analisi di spettrometria di massa potrebbero portare ulteriore contributo all identificazione del contenuto. Dal momento che il prodotto, secondo l indicazione del Produttore, è somministrabile non solo per via parenterale ma anche per bocca, non ci sembra che assunto per os presenti particolari rischi per la salute. Non vediamo, invece, la necessità di iniettarla all interno del corpo umano, specialmente in neonati. A nostro parere la Ditta produttrice dovrebbe dichiarare quali controlli esegua riguardo le eventuali contaminazioni da polveri; quanto siano i corpi estranei eventualmente individuati; quanto questi corpi estranei siano rischiosi per la salute. 7. Riferimenti bibliografici 1 A.M. Gatti, S. Montanari Nanopathology: the health effects of nanoparticles Ed. Pan Stanford, Singapore, 2008, Appendix, 1-290, ISBN A.M. Gatti, S. Montanari Case studies in nanotoxicology and particle toxicology, Elsevier, USA, 2015,
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