WP4-Biocontrollo DIPARTIMENTO DI PRODUZIONE VEGETALE

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1 DIPARTIMENTO DI PRODUZIONE VEGETALE Piattaforma di biotecnologie verdi e di tecniche gestionali per un sistema agricolo ad elevata sostenibilità ambientale- BIOGESTECA finanziato dal Fondo per la promozione di Accordi Istituzionali della Regione Lombardia. WP4-Biocontrollo KICK-OFF MEETING Dr. Roberto Pilu 8 Giugno 2011

2 Biocontrollo

3 Attività 1 - FLC - RIS Dr. Piffanelli Attività 2 Prof. Daffonchio - MAC - RIS Attività 3 Dr.Pilu Attività 4 Dr. Scarafoni - MAC

4 Il biocontrollo in agricoltura (sostenibile) è effettuato con un insieme di tecniche utilizzate per controllare gli organismi che danneggiano i raccolti, in particolare i patogeni delle piante, con il fine di ridurre l utilizzo di agrofarmaci di sintesi. Come viene effettuato: - Scegliendo/modificando i genotipi delle piante - Utilizzando sostanze naturali - Utilizzando organismi benefici ad attività antagonista DIGITARE NOME DIPARTIMENTO SECONDA RIGA NOME DIPARTIMENTO

5 Tecniche di biocontrollo WP4 Patogeno Attività 2 microrganismi con attività antagonista Attività 4 Attività 1 -Trattamenti con bioestratti (eg. proteine, alcaloidi, etc) Pianta suscettibile Attività 3 Attività 1 - Scelta varietale - Costituzione nuove varietà tramite incrocio e MAS - Mutagenesi - Genomica funzionale Pianta resistente

6 WP4 riso mais

7 Foto Ente Nazionale Risi - FLC - RIS BRUSONE - grave malattia fungina del riso a distribuzione mondiale - distrugge totalmente le colture in aree tropicali - arreca danni superiori al 50% della produzione nei climi temperati - provocata dal fungo Pyricularia grisea La patologia si può manifestare sulle foglie, sui nodi e i culmi, provocando il BRUSONE FOGLIARE e MAL DEL COLLO P. grisea X1000 Brusone fogliare Mal del collo MAL DEL COLLO è la sintomatologia più dannosa in campo perché la spiga deperisce e secca nella fase iniziale della fioritura

8 Il patrimonio varietale italiano, caratterizzato da varietà in gran parte sensibili a questo patogeno. Le soluzioni per il controllo del patogeno sono oggi costituite essenzialmente dall utilizzo di prodotti fitosanitari ad azione fungicida. Questi prodotti garantiscono un buon controllo della malattia, a patto che vengano applicati sulla coltura nel momento giusto. Le molecole disponibili sono: triciclazolo (Beam DAS), Azoxistrobin (Amistar) flutriafol (Impact 250 SC). Prevenire il brusone è la difesa più efficace I fattori predisponenti la malattia sono molteplici. Oltre alle condizioni ambientali è importante anche la tecnica di coltivazione: la scelta dei piani di concimazione può determinare in senso positivo o negativo l evoluzione della malattia. L azoto costituisce infatti il principale elemento nutritivo per il riso, ma concimazioni squilibrate determinano una maggior permeabilità cuticolare (strato di cere che ricoprono la foglia) e una scarsa silicizzazione delle pareti cellulari, che rendono la pianta meno resistente alla malattia.

9 Il BRUSONE E ANCHE UN PROBLEMA AMBIENTALE per l utilizzo abitudinario di fungicidi di sintesi ad azione preventiva necessario SISTEMA DI BIOCONTROLLO DEL BRUSONE a basso impatto ambientale per la sostenibilità della produzione del riso VANTAGGI difesa ad ampio spettro e durevole del riso dal brusone sostenibilità della produzione del riso nel rispetto dell ambiente mantenimento della biodiversità dell ecosistema risaia vantaggio economico per l agricoltore competitività sul mercato del riso lombardo sicurezza alimentare per i consumatori

10 1) ricerca dei geni chiave coinvolti nella difesa del riso da brusone e analisi della risposta del riso a elicitori che innalzano o inducono le difese innate della pianta a P.grisea 2) Studio e analisi di sostanze naturali ad attività antifungicida da utilizzare nella lotta biologica contro Pyricularia grisea in riso Attività antifungina di una sostanza naturale contro P. grisea Erba medica (Medicago sativa) Pianta ricca in saponine Medicago sativa

11 SAPONINE - metaboliti secondari delle piante, soprattutto leguminose - prodotte per la difesa da stress biotici e abiotici - nota attività antimicrobica, antimicotica, insetticida, azione nutraceutica (anticolesterolemica) ed azione farmacologica (coadiuvanti in terapie antitumorali) - presenti nella pianta in concentrazione variabile Lo studio implicherà: HO HO HO OH HO H3C HO HO glucuronic acid HOOC O HO O O O O rhamnose O galactose soyasapogenol B OH OH - Valutazione in vitro dell attività antifungina e/o fungistatica di saponine isolate da Medicago verso ceppi di P.grisea di collezione storiche e isolati durante il progetto -- Studio della variabilità allelica in erba medica per i geni coinvolti nella biosintesi di saponine -Caratterizzazione genotipica e catalogazione di ceppi P.grisea isolati durante il progetto - Analisi dell efficacia di queste molecole contro ceppi di P.grisea in planta in condizioni controllate - Analisi dell attività fungicida/fungistatica delle saponine in pieno campo

12 - MAC - RIS In natura sono presenti microrganismi associati alle piante ed in grado di contrastare lo sviluppo di agenti fitopatogeni esercitando una funzione di biocontrollo attraverso fenomeni di competizione per nicchie ecologiche e substrati, produzione di inibitori, antibiotici, cianidi, enzimi litici etc.. Tra la popolazione dei batteri nel suolo sono presenti promotori di crescita delle piante. e.g.

13 Isolamento da campioni di rizosfera e tessuti radicali L attività prevede dapprima l ottenimento di un ampia collezione di isolati batterici dalle radici e dalla rizosfera delle piante di mais e di riso che non presentano sintomi delle fitopatologie in oggetto. (1) Endosfera (2) Rizosfera Arricchimento per batteri con attività ACC deaminasica [Penrose and Glick, 2003] Collezione di isolati batterici con potenziale attività di biocontrollo DF + ACC CFU/g

14 Screening in vitro per attività di biocontrollo Produzione di chitinasi Produzione di proteasi Produzione di endoglucanasi Formazione di biofilm Produzione di ammoniaca Sintesi di HCN

15 Gli isolati saranno quindi valutate con saggi in vitro. L attività antagonista diretta nei confronti di colture pure del fitopatogeno verrà valutata con saggi in vitro. Metodo Cross Streaking In una seconda fase si procederà quindi per gli isolati microbici con attività polivalenti e/o particolarmente intense, verranno condotti esperimenti in planta, volti a stabilire: - la competenza dei ceppi nella colonizzazione della rizosfera - la capacità di crescere come endofiti - l attività di biocontrollo in vivo, su piante artificialmente contaminate dai fitopatogeni in ambiente confinato e in prove pilota in pieno campo. Metodo Agar Well Diffusion

16 Il mais è una delle più importanti colture agrarie, in particolar modo nel territorio lombardo ed in generale in tutta la Pianura Padana (resa media in Pianura Padana c.a 11 t/ha); tra i principali fattori che possono diminuire la qualità dei prodotti finali riscontriamo le micotossine. Le micotossine sono metaboliti tossici prodotti da alcune specie fungine le micotossine più diffuse in ambito agrario: AFLATOSSINE: tossine prodotte da Aspergillus flavus ed A. parasiticus. OCRATOSSINE: tossine prodotte da A. ochraceus e Penicillum verrucosum. DESOSSINIVALENOLO E ZEARALENONE: prodotte da Fusarium culmorum e F. graminearum. FUMONISINE: tossine prodotte principalmente da F. verticillioides (ex F. moniliforme).

17 LE FUMONISINE LE FUMONISINE sono metaboliti tossici principalmente, prodotte da Fusarium verticillioides, chimicamente sono composti alifatici a 20 atomi di carbonio, sono idrofile e non presentano gruppi cromogeni distinguibili ai raggi UV. Attualmente sono noti 8 tipi di fumonisine: FB 1, 2, 3, 4, 5; FA 1,2; FC 1, 2. Le più diffuse sono le FB 1 e 2. fumonisina FUMONISINE E LIMITI DI LEGGE - Per granella di mais non trasformata, destinata alla produzione di prodotti per l alimentazione umana: sono ammessi 4000 µg / Kg (di granella) di fumonisine, pari a 4000 ppb = 4 ppm (Reg. CE 1126/07). - Per granella di mais non trasformata, destinata alla produzione di alimenti per animali: sono ammessi 60 mg / Kg (di granella) di fumonisine, pari a 60 ppm (Reg. CE 585/06).

18 Distribuzione delle tossine prodotte dal Fusarium in Europa 0-75% of the mean % of the mean % of the mean >250% of the mean Tra le micotossine, soprattutto le fumonisine rappresentano il vero problema in Italia, in quanto risultano essere quelle più diffuse.

19 Strategie di controllo del Fusarium Approccio integrato Tecniche agronomiche Miglioramento genetico Controllo con agrofarmaci PIRALIDE DEL MAIS (Ostrinia nubilalis) miscela Nomolt+Contest

20 Gli antociani sono i pigmenti rossi e blu presenti in fiori e frutti - Proteggono dalle malattie cardiovascolari - Inibiscono la formazione di tumori - Proteggono da malattie neurodegenerative - Migliorano la vista Nel mais la via biosintetica che porta all accumulo di antocianine nel seme è attivata da due tipi di geni regolatori: la famiglia dei geni C1/Pl1 e R1/B1. La presenza di almeno un gene per famiglia consente la trascrizione dei geni strutturali. P1 è il gene regolatore dei flobafeni, accumulati nel pericarpo.

21 Azienda Agricola Angelo Menozzi Landriano (PV) Campi sperimentali dove vengono eseguiti incroci controllati e la produzione di piccoli quantitativi di materiale per le varie analisi e collaborazioni Campi sperimentali

22 mg Antocianine/100g farina Obiettivi - Costituzione dei materiali genetici - Caratterizzazione molecolare - Caratterizzazione chimica - Prove agronomiche in diverse località Effetto di geni di resistenza/trattamento antipiralide sulla contaminazione da Fusarium spp. e Aspergillus spp. Confrontare stato sanitario dei materiali (resistente e suscettibile, trattate e non trattate) alla raccolta: -incidenza marciumi fungini -infezioni fungine latenti -accumulo micotossine TLC HPLC incolore colorato sel colorato

23 - MAC La concia chimica delle sementi, in particolare quelle di mais, è un trattamento protettivo effettuato con sostanze biocide (insetticidi e fungicidi) allo scopo di contrastare preventivamente patogeni presenti nel terreno o negli strati superficiali del tegumento del seme riducendo i danni che questi possono arrecare al seme stesso o alla giovane plantula che si svilupperà. Il ricorso alla concia può avere importanti ripercussioni ambientali, come recentemente ipotizzato per i principi attivi nicotinoidi. Al di là di casi particolari di tossicità acuta per l ambiente, i concianti vanno ad aggiungersi ai presidi fitosanatiari di sintesi che immessi in agricoltura possono accumularsi nei suoli e nelle acque superficiali e di falda. (e.g. Gaucho 350FS, Regent, Cruiser 350FS, Poncho, etc.) Il seme di mais conciato con questi prodotti, si pensa possa causare mortalità e spopolamenti degli alveari, infatti gli apicoltori con apiari dislocati in aree maidicole del nord Italia lamentano nel periodo di semina della coltura,

24 Un alternativa per un uso più limitato di concianti potrebbe essere quella di ricorrere alle naturali resistenze della pianta, valorizzandole in una ottica applicativa. E noto infatti che durante le prime fasi della germinazione, i semi, sia di piante monocotiledoni sia di piante dicotiledoni, rilasciano nel loro intorno diversi tipi di molecole, tra cui numerosi peptidi e proteine. La spermosfera rappresenta la zona del suolo che circonda il seme, è di breve durata, molto variabile e microbiologicamente dinamica. Protein concentration Protein concentration mol K + mol K + Protein concentration ( g/ l) Red line: Total proteins K + ( molar) DIGITARE NOME DIPARTIMENTO SECONDA RIGA NOME DIPARTIMENTO Time (hours)

25 Tra queste, quelle maggiormente rappresentate sono proteine (es. defensine, etc) che mostrano attività antimicrobica in grado di inibire la crescita di specie patogene (Conceicao and Broekaert, 1999; Ferreira et al., 2007). Alcuni di questi peptidi si trovano già accumulati nel seme, altri vengono sintetizzati ex novo durante le prime fasi della germinazione, altri ancora si originano dalla digestione endogena di proteine di riserva già presenti nei semi, come ad esempio le viciline, globuline presenti in discrete quantità nel mais. Proteine di deposito presenti nel seme Germinazione Idrolisi delle proteine con accumulo di peptidi Attività antifungina Rilascio di proteine e peptidi nell ambiente Durante la germinazione il seme e il suolo circostante costituiscono un habitat ricco per lo sviluppo e l interazione microbica. La principale fonte d energia per i microrganismi in questo habitat è il carbonio rilasciato dal seme nel suolo circostante.

26 Obiettivi - Esplorazione del germoplasma di mais, verranno analizzati diversi genotipi collezionati - Purificazione della frazione proteica da altri composti (polisaccaridi e molecole organiche a basso peso molecolare) H 2 O Germinazione in vitro - Analisi quantitativa dei peptidi e delle proteine rilasciate nel mezzo mediante approcci di tipo proteomico - Test di attività biologica delle miscele peptiche ottenute dalle diverse linee saranno saggiate, per la loro attività biocida nei confronti di specie fungine potenzialmente patogene per le piante. Ogni 12 h Analisi del mezzo di germinazione Saggi di inibizione fungina Caratterizzazione molecolare

27 DIPARTIMENTO DI PRODUZIONE VEGETALE Grazie per l attenzione Dr. Roberto Pilu 8 Giugno 2011