Dott. M. Stella Grando, Christian Cainelli, Claudia Bisognin Redazione Dott. Wolfgang Jarausch Dott. Claudio Ioriatti. Foto: Mauro Varner

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1 S MAP Notizie Scopazzi del melo - Apple proliferation Anno 2 Numero 1 Gennaio 2007 Sommario Istituto Agrario di San Michele Centro Sperimentale Via E. Mach San Michele all Adige (TN) Applicazioni della PCR quantitativa alla diagnosi molecolare di Apple Proliferation Dott. M. Stella Grando, Christian Cainelli, Claudia Bisognin Redazione Dott. Wolfgang Jarausch Dott. Claudio Ioriatti Foto: Mauro Varner Partner del progetto Istituto Agrario di San Michele, Centro Sperimentale AlPlanta IPR, RLP AgroScience Neustadt, Germania Biologische Bundesanstalt Dossenheim, Germania Progetto Grafico Nicola Zuin 1

2 S MAP Notizie Anno 2 Numero 1 Gennaio 2007 APPLICAZIONI DELLA PCR QUANTITATIVA ALLA DIAGNOSI MOLECOLARE DI APPLE PROLIFERATION Dott. M. Stella Grando, Christian Cainelli, Claudia Bisognin Istituto Agrario di S. Michele all Adige, Centro Sperimentale. Via E. Mach, San Michele all Adige (TN) Per stabilire se una pianta di melo è affetta dal fitoplasma AP ci si può basare sulla comparsa dei sintomi tipici della malattia degli scopazzi, ma è certamente più informativo individuare direttamente la presenza del patogeno. Trattandosi di un microrganismo che non cresce fuori dai tessuti ospiti, AP può solo essere diagnosticato in un campione di pianta o negli insetti che dalla pianta lo assumono. Riconoscere un infezione prima che la malattia si manifesti, controllare lo stato sanitario delle piante in vivaio, come pure monitorare la presenza di AP nelle popolazioni di vettori naturali, sono alcune delle importanti operazioni possibili grazie a metodi di diagnosi diretta, specifica e sensibile. Fin dagli inizi, il progetto SMAP ha applicato le metodologie diagnostiche più evolute per descrivere la situazione della malattia e fornire un supporto alle decisioni dei tecnici e degli agricoltori. Come descritto in altre occasioni (Ciccotti et al., 2005) l identificazione di AP è stata basata principalmente su applicazioni della PCR, ovvero di una reazione enzimatica condotta in laboratorio capace di evidenziare la presenza di DNA del patogeno nel campione. Questa analisi molecolare è stata ed è di grande utilità per le numerose risposte fornite. Infatti, poiché i campioni di piante o gli insetti che si indagano come possibili vettori di AP possono essere processati in modo semi-automatico in numeri discretamente elevati, la PCR si presta ad analisi di routine. Ci sono tuttavia molte questioni ancora aperte sulla malattia degli scopazzi che non si risolvono con la semplice associazione alla presenza del fitoplasma, ma richiedono la generazione di nuove informazioni. Fra queste, per esempio, indicazioni sulla carica di fitoplasma presente in un determinato tessuto della pianta o dell insetto potenziale vettore e la conseguente possibilità di stabilire una dinamica di tale presenza quantitativa nel tempo. La comparsa dei sintomi, la gravità della malattia, la sua remissione, ma anche la possibilità degli insetti vettori di acquisire e diffondere il patogeno sono fenomeni che possono essere compresi generando dati sulla concentrazione del fitoplasma nelle diverse situazioni del frutteto. 2

3 Esiste una tecnologia che sfruttando i principi della PCR e altre proprietà degli acidi nucleici (DNA, RNA) permette di risalire al numero di fitoplasmi presenti in una certa porzione di pianta o di insetto: si tratta della real-time PCR o PCR quantitativa (qpcr). Con alcune versioni applicative e a fronte di un differente costo per analisi, questa tecnica offre anche un aumento della sensibilità di detection, ovvero la possibilità di individuare tracce di fitoplasmi in materiali che in precedenza potevano essere ritenuti sani. La preparazione dei campioni biologici per questa analisi non è diversa da quella per una comune PCR e consiste quindi nella triturazione dei tessuti e nell isolamento del DNA totale. Fra questo, oltre al DNA delle cellule vegetali o dell insetto, a seconda dell origine del materiale biologico, si trova anche il DNA del fitoplasma. La reazione di PCR è concepita infatti per dimostrare la presenza di uno specifico tratto di DNA, in questo caso peculiare del patogeno AP. Per effettuare la real-time PCR, il normale termociclatore usato per la PCR è stato implementato con un sistema di rilevazione per emissioni fluorescenti e ha portato alla generazione di nuove strumentazioni. In sintesi, la quantità di segnale emesso da ogni campione durante la reazione è correlata al numero di copie di fitoplasma presenti. Esistono varie soluzioni, che differiscono per sensibilità e costi delle singole analisi, per produrre il segnale fluorescente durante la PCR quantitativa. Nello schema seguente è riassunto il meccanismo della reazione basata sull impiego di una sonda molecolare che si appaia in modo altamente specifico alla sequenza del DNA del patogeno. Lo svolgimento della PCR produce la rottura della sonda e la conseguente emissione di un segnale fluorescente proporzionale al numero di copie della stessa, e quindi del patogeno presente nel campione. E tuttavia importante comprendere che generalmente il dato quantitativo non ha un valore assoluto, ma va rapportato al tipo di campione biologico analizzato e comparato solo in opportune condizioni. Allo stato attuale delle conoscenze sulla distribuzione di AP nei vari segmenti della pianta e nel corso delle stagioni, come pure nel corpo degli insetti, il risultato di una PCR quantitativa ottenuto da un campione di campo estemporaneo, ovvero fuori da un piano sperimentale, non può quindi fornire altre informazioni che la presenza o l assenza del fitoplasma. 3

4 Nei laboratori IASMA e dei partner del progetto SMAP, apparecchiature per real-time PCR sono in funzione da diversi anni, per attività di ricerca e per esigenze di diagnostica quantitativa. Interessanti risultati sono stati già ottenuti con questa tecnica e notevole è stato anche il contributo dei ricercatori alla messa a punto di protocolli analitici e alla valutazione dei dati. STRUMENTO PER REAL-TIME PCR Gli esperimenti di quantificazione della presenza di AP basati su Real-time PCR hanno riguardato finora due importanti linee di ricerca nell ambito di SMAP: la trasmissione del fitoplasma da parte di insetti; la caratterizzazione della resistenza dei portainnesti apomittici. QUANTIFICAZIONE DI FITOPLASMI AP NEGLI INSETTI E noto che diverse specie di Psille e Afidi sono risultate positive alla presenza di AP nell ambiente coltivato trentino, nel corso degli ultimi anni di indagine. Tuttavia le molte prove allestite in condizioni controllate, per studiare le capacità dell insetto di trasmettere la malattia, hanno provato l efficienza di vettore solo per Cacopsylla picta. A partire da questa osservazione, la misurazione della concentrazione di fitoplasma nel corpo dei vari insetti, ha fornito una chiave di lettura piuttosto chiara, anche se restano ancora altri aspetti da approfondire. Nelle singole Psille, infatti, si rilevano normalmente decine di milioni di copie di fitoplasma, mentre valori nettamente più bassi (spesso inferiori al milione) sono stati evidenziati nelle specie di Afidi che vivono su melo (TAB. 1). Sembra dunque che vari insetti possano acquisire il fitoplasma, ma che solo in specifici ospiti questo microrganismo riesca a raggiungere le quantità che determinano una reale capacità infettiva. Le analisi quantitative cercheranno ora di stabilire la ripartizione del fitoplasma nei segmenti del corpo (capo, addome), la concentrazione che AP può assumere nei vari stadi di sviluppo del vettore e le dinamiche legate all assunzione del patogeno dalla pianta, come pure quelle della sua permanenza nell insetto. 4

5 TAB. 1 Quantificazione di fitoplasmi AP negli insetti Specie Copie di AP Specie Copie di AP Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta Afide verde Psilla Picta QUANTIFICAZIONE DI FITOPLASMI AP NEI GENOTIPI APOMITTICI Un altra applicazione della diagnosi quantitativa del fitoplasma mediante Real-time PCR, riguarda la sperimentazione su piante infettate in vitro. Per valutare il grado di resistenza ad AP dei materiali derivati dai portainnesti apomittici e dai loro progenitori selvatici, si è pensato di misurare la capacità del patogeno di colonizzare piantine di melo una volta microinnestate con materiale infetto, in condizioni controllate. Il presupposto è che piante variamente suscettibili, tolleranti o resistenti possano opporre reazioni diverse alla invasione dei loro tessuti da parte di un patogeno trasmesso per contatto di parti vegetali. Queste informazioni sono molto importanti per la selezione di nuove varietà più tolleranti alla malattia degli scopazzi e nello stesso tempo sono utili per stabilire associazioni con il genotipo molecolare dei materiali apomittici. Infatti vengono usate per identificare indicatori genetici (marcatori) della resistenza o suscettibilità, allo scopo di facilitare il lavoro di miglioramento genetico delle cultivars di melo. INNESTO IN VITRO In pratica, le varietà di cui si vuole testare la resistenza/tolleranza sono poste in coltura in vitro e innestate con una comune sorgente di infezione (es. Golden), pure mantenuta in vitro. 5

6 Dopo l attecchimento dell innesto in vitro, a cadenza periodica vengono prelevate delle porzioni di tessuto dalle piantine usate come portainnesto. Su tali campioni, l analisi quantitativa con Real-time PCR permette di stabilire quanto patogeno è passato e come la concentrazione di fitoplasma evolve nel tempo all interno della pianta considerata. L allestimento di questi esperimenti, che hanno coinvolto in parallelo i laboratori di IASMA e quelli di AlPlanta (Neustadt, D), è stato molto impegnativo per la necessità di adattare le condizioni di coltura in vitro ai numerosi e diversi genotipi da valutare. Inoltre, per cercare di stabilire anche eventuali differenze nella resistenza alle diverse tipologie di patogeno, il microinnesto è stato effettuato con materiali infetti da ceppi diversi del fitoplasma. Queste prove, sono di rilevante importanza anche per misurare la virulenza dei vari tipi di patogeno. Nella figura seguente è riportato un esempio del numero di copie di fitoplasma AP (per nanogrammo di DNA di melo nel campione) determinate in differenti genotipi inoculati per microinnesto in vitro. Alla base delle differenze, vi può essere una maggiore o minore suscettibilità di questi genotipi alla malattia copie di AP/ng di DNA di Malus sp G. delicious h.1 h.2 h.3 h.4 h.5 h.6 h.7 h.8 h.9 h.10 h.11 h.12 h.13 h.14 h.15 genotipo La sperimentazione descritta si affianca alle valutazioni correnti di resistenza dei genotipi apomittici in condizioni di campo, rese però particolarmente complicate dall influenza delle numerose variabili ambientali e dove l inoculo difficilmente può essere omogeneo e contemporaneo. Tuttavia, presso il BBA (Biologische Bundesantalt für Land- und Forstwirtschaft) Dossenheim, dove le osservazioni su portainnesti apomittici inoculati con AP sono in corso da lungo tempo, il Prof. Seemüller ha recentemente messo a confronto la concentrazione del fitoplasma trovato nel floema radicale dei genotipi resistenti con quella di alcuni portainnesti commerciali. I risultati, riportati in parte nella tabella seguente, sembrano effettivamente riflettere il diverso comportamento di queste piante nei confronti della malattia. 6

7 TAB. 2 Concentrazione del fitoplasma trovato nel floema radicale dei genotipi suscettibili e resistenti Varietà Portainnesto AP/grammo di tessuto radicale M M Malus sieboldii D D Riferimenti Ciccotti AM, Cainelli C, Bragagna P, Bianchedi P, Pedrazzoli F, Bisognin C, Grando MS (2005) Approcci diagnostici applicati nel progetto SMAP. Terra Trentina 4,