Prof. Maria Nicola GADALETA

Транскрипт

1 Prof. Maria Nicola GADALETA Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Biochimica e Biotecnologie Biochimiche DISPENSA N. 1 T CENTRIFUGAZIONE

2 Centrifugazione Tecnica comunissima in biochimica, basilare per la separazione delle biomolecole e degli organuli cellulari. Permette la separazione meccanica in un mezzo liquido di materiali solidi dal liquido e di materiali solidi tra loro sottoponendoli ad una forza centrifuga. Materiali di FORMA, DIMENSIONI, DENSITA diversa, posti in un campo centrifugo, sedimentano con velocità diversa. cellule organuli subcellulari macromolecole

3 CENTRIFUGAZIONE Le tecniche centrifugative si possono suddividere in generale in: preparative e analitiche La centrifugazione preparativa permette di separare e purificare cellule intere, organuli subcellulari e macromolecole biologiche come acidi nucleici o proteine. La centrifugazione analitica permette invece di studiare le caratteristiche di sedimentazione del campione e di determinarne il grado di purezza o la massa molecolare. Questa centrifugazione richiede quantità minime di materiale e utilizza rotori e sistemi di rilevamento più sensibili e molto più costosi.

4 La forza centrifuga è la forza uguale e contraria che si oppone alla Forza Centripeta, cioè a quella forza che impedisce ad un corpo, animato di moto circolare uniforme, di sfuggire per inerzia nella direzione del moto (ossia nella direzione della tangente alla traiettoria). La Forza Centripeta è perpendicolare alla traiettoria e diretta verso il centro di rotazione mentre la Forza Centrifuga ha la stessa direzione, ma verso opposto.

5 Forza Centrifuga La Forza Centrifuga è perpendicolare all asse di rotazione e diretta verso l esterno F.C. = m ω 2 r m = massa della particella ω = velocità angolare del sistema r = raggio (distanza della particella dall asse di rotazione) ω 2 r m = grammi ω = rad/sec r = cm = accelerazione angolare che definisce il campo centrifugo. La F.C. dipende dal quadrato di ω 2 quindi per aumentare F.C. conviene aumentare questa piuttosto che r F.C. = Dine

6 rpm e RCF La Velocità Angolare ( omega ) può essere espressa anche in r.p.m. ω = 2π rpm 60 Per esprimere la F.C. è comodo definire il seguente rapporto: f.centrif m ω 2 r = f.gravità m g ω 2 r = = g R.C.F. Forza Centrifuga Relativa E improprio chiamarla forza: ci dice di quante volte l accelerazione a cui è sottoposta la particella è più grande della accelerazione di gravità Sostituendo: g=980cm s -2 R.C.F. 4π = 2 rpm 2 r cm/sec 2 R.C.F. = 1, rpm 2 r La R.C.F. è funzione della velocità di rotazione (rpm) e della distanza dall asse di rotazione (r), quindi se sottoposte alla stessa R.C.F., particelle di massa diversa sedimentano con velocità diversa che dipende in gran parte dalla loro massa.

7 Nomogramma Per descrivere le modalità di centrifugazione in maniera completa bisogna indicare: o la R.C.F (come multiplo della forza di gravità, cioè di g) o la velocità di rotazione (rpm) + il raggio del sistema (r=dipende dal rotore usato) N.B. rpm = revolution per minute= giri al min. Il nomogramma serve per convertire i g in rpm quando è noto il rotore che si deve adoperare e quindi si conosce r

8 Centrifugazione preparativa La centrifugazione preparativa comprende: centrifugazione differenziale, centrifugazione in gradiente di densità La centrifugazione differenziale si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle tra loro diverse per densità e dimensioni; la centrifugazione porterà inizialmente alla sedimentazione delle particelle di maggiori dimensioni. Se le particelle hanno la stessa massa ma densità diversa, quelle con densità maggiore sedimenteranno più rapidamente di quelle meno dense.

9 Centrifugazione differenziale (Pelleting):FRAZIONAMENTO CELLULARE Il materiale da frazionare viene separato in un certo numero di frazioni mediante centrifugazioni successive in cui aumenta di volta in volta la forza centrifuga applicata (CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE). Dopo ciascuna centrifugazione vi è la separazione in due distinte fasi: - Sovranatante - Sedimento (Pellet) La velocità di sedimentazione dipenderà dalle dimensioni e dalla densità della particella; L efficienza del Pelleting sarà proporzionale alla forza di gravità (RCF) applicata e al tempo di centrifugazione.

10 Frazionamento cellulare Il frazionamento cellulare ha lo scopo di isolare le strutture subcellulari per: Lo studio della morfologia, composizione e attività dei componenti La separazione di sostanze con caratteristica localizzazione subcellulare (DNA, Enzimi, CoEnzimi ecc) L integrazione delle attività di componenti subcellulari isolati Importante nel frazionamento cellulare è: La scelta del materiale di partenza (es fegato, cellule ecc) L omogeneizzazione (se si parte da tessuti) con Waring blendor, Potter ecc. L uso di opportuni tamponi, per es.isotonici con l ambiente cellulare in cui la struttura subcellulare si trova (es. una soluzione salina; una soluzione 0,25 M di saccarosio per l integrità dei mitocondri )

11 Centrifugazione differenziale Fr da Kleinsmith Fig 4-29

12 Marcatori di frazioni subcellulari Kleinsmith &Kish, tab 4-2

13 Marcatori di frazioni subcellulari Kleinsmith &Kish, fig 4-30

14 Centrifugazione in gradiente di densità Il gradiente di densità può considerarsi come una colonna di una soluzione la cui densità è crescente man mano che si raggiunge il fondo della provetta. Caratteristiche del gradiente di densità: riduce al minimo le perturbazioni dovute ai moti convettivi, evitando il rimescolamento permette la separazione di particelle con dimensioni simili e con diversa densità Realizzazione di gradienti Soluti usati sali di metalli pesanti (Cloruro di Cesio) molecole organiche (Glicerolo, Saccarosio), polimeri (Ficoll, destrano) sostanze ad alto peso molecolare Forma dei Continui (proteine, ac. nucleici ecc) mediante un Gradienti formatore di gradienti. Maggiore risoluzione Discontinui (ribosomi, virus ecc) mediante stratificazione successiva della soluzione a concentrazione e quindi a densità decrescente

15 Metodi di centrifugazione in gradiente di densità La centrifugazione su gradiente di densità può essere : ZONALE o ISOPCNICA La Centrifugazione Zonale Sfrutta le differenze di dimensione e forma delle particelle. Le particelle sono stratificate alla sommità del gradiente. Sotto l azione della F.C. le particelle si disporranno in zone del gradiente contenenti ciascuna particelle con stessa velocità di sedimentazione. La separazione dipende dal tempo (se si centrifuga per molto tempo le particelle si stratificano tutte sul fondo essendo la densità del gradiente inferiore alla densità delle componenti da separare). Esistono Gradienti continui preformati e apparecchietti per formarli. La densità delle particelle deve essere maggiore della densità di ogni specifica posizione del gradiente. La corsa deve essere terminata prima che ogni particella raggiunga il fondo del tubo se no si ha un rimescolamento delle frazioni stesse. Es. Separare rrna da altri RNA in gradiente di saccarosio.

16 Centrifugazione zonale A Z Campo centrifugo Campione Gradiente di densità Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi All inizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densità e della densità del mezzo.

17 La Centrifugazione Isopicnica (isodensità) o della densità all equilibrio Sfrutta la densità delle particelle (e non la forma o la dimensione) Il gradiente comprende tutti i valori di densità delle particelle da separare. La particella si arresterà nella zona del gradiente la cui densità è pari a quella della particella. È una separazione dipendente solo dalla differenza di densità e non dal tempo. A volte il gradiente non è preformato ma si forma per effetto della F.C. sulle molecole del soluto. Gradienti continui e discontinui. Es. Separazione diverse forme di DNA in base alla diversa densità specifica (esperimento di Meselson e Stahl).

18 Centrifugazione isopicnica con A gradiente Z Campo centrifugo Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi All inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A), durante la centrifugazione si forma il gradiente, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densità del gradiente uguale alla loro.

19 Ultracentrifugazione E una procedura in cui si utilizzano centrifughe capaci di imprimere al rotore regimi rotazionali estremamente elevati rpm. Il rotore gira in una camera blindata ove viene praticato il vuoto. Ultracentrifugazione preparativa: per separare particelle piccole: microsomi,ribosomi, batteri, virus, ac. nucleici e proteine. Ultracentrifugazione analitica: utilizza un sistema ottico che permette di visualizzare il processo di sedimentazione man mano che si verifica. E possibile caratterizzare: coef. sedimentazione, coef. diffusione, peso molecolare, densità, misura concentrazione e omogeneità di una soluzione.

20 La legge di Stokes esprime la relazione tra velocità di sedimentazione, dimensioni, forma e densità delle particelle e viscosità del mezzo. ν = 2 9 a 2 ( ρ ) p m 2 η ρ ω r 2/9 = coef. per particella sferica V= dx/dt; velocità percorsa dalla particella a = raggio particella (cm) η = viscosità del mezzo (poises) ρ = densità particella o del mezzo s = v/ω 2 r ω 2 r = campo centrifugo Il coefficiente di sedimentazione s esprime la velocità di sedimentazione di una particella per unità di campo centrifugo.

21 Centrifuga analitica Per la determinazione del coefficiente di sedimentazione si centrifuga in un solvente a bassa densità misurando in tempi diversi la velocità del movimento del boundary (cm/sec).

22 Coefficienti di sedimentazione delle principali strutture biologiche: Proteine 2-25 S Acidi nucleici S Virus S Lisosomi 4000 S Mitocondri 20 X X 10 3 S Membrane 100 X 10 3 S Nuclei 4000 X X 10 3 S Il coefficiente di sedimentazione è espresso in secondi e dipende dalla temperatura, dalla densità e dalla viscosità della soluzione. Poiché gli studi di velocità di sedimentazione vengono condotti impiegando svariati sistemi solutosolvente, per convenzione si usa correggere il coefficiente di sedimentazione trovato sperimentalmente in quel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui densità e viscosità fosse pari a quello dell'acqua a 20 C:coefficiente di sedimentazione standard o s 20,w. S = Svedberg = sec.

23 Centrifughe Centrifughe da banco preparative analitiche separazioni rapide di sospensioni grossolane separazioni preparative di particelle diverse fra loro Analisi di particelle già pure per studiare le caratteristiche di sedimentazione delle macromolecole o strutture organiche che interessano

24 Centrifughe e rotori

25 Rotori Rotore ad angolo fisso I rotori ad angolo fisso hanno piccole differenze tra r max e r min Il tempo richiesto per la sedimentazione è minore per rotori ad angolo fisso I rotori ad angolo fisso sono più pesanti e necessitano di una maggiore energia per operare I rotori a bracci mobili (Swing out) sono da preferire per centrifugare cellule e particelle Per sedimentare macromolecole e particelle fini si usano rotori ad angolo fisso I rotori a bracci mobili sono da preferire per la centrifugazione su gradiente. r max - r min Rotore swing-out r max - r min

26 ESERCITAZIONE: Centrifugazione e frazionamento cellulare: isolamento di mitocondri. Isolamento di mitocondri da fegato di ratto mediante centrifugazione differenziale Preparare 50 ml di una soluzione composta da: Saccarosio 0,25 M, Tris 10 mm ph 7,4, EDTA 1 mm. Calcolare quanti grammi di saccarosio (PM 342,30)..., quanti ml di Tris a partire da una soluzione madre 1M..., quanti ml di EDTA a partire da una soluzione madre 0,1 M..., sono necessari per preparare la soluzione. Raffreddare la soluzione in ghiaccio. Omogeneizzare meccanicamente circa 2 g di fegato di ratto (prelevato da animale sacrificato in precedenza e congelato in azoto liquido) mediante pestello e mortaio in presenza di azoto liquido, così da mantenere il campione congelato durante la procedura. Raccogliere la polvere del campione, trasferirla in un potter e risospenderla in 10 ml della soluzione preparata in precedenza. Omogeneizzare a velocità media con 3-5 colpi di potter fino ad ottenere una sospensione omogenea all aspetto. Trasferire l omogenato in 1 tubo da 15 ml.

27 Centrifugare la sospensione a 500 x g, in rotore a 4 C per 5 min per far sedimentare nuclei e frammenti cellulari. Prelevare il sovranatante, trasferirlo in altri tubi e centrifugare a 6000 x g, in rotore JA-20, a 4 C per 10 min per far sedimentare i mitocondri. Risospendere ciascun pellet di mitocondri in 1 ml di soluzione di saccarosio, trasferirlo in eppendorf e omogenarlo a mano con un micropestello. Conservare i mitocondri a 20 C per il successivo dosaggio delle proteine.