La replicazione del DNA

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1 Genetica 4

2 La replicazione del DNA

3 Dalla struttura tridimensionale del DNA scoperta nel 1953, si possono ipotizzare 3 tipi di replicazione: Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

4 Possibili Meccanismi di replicazione del DNA Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

5 Esperimento di Meselson e Stahl Meselson e Stahl impiegarono la centrifugazione in gradiente di densità per distinguere DNA contenente 14 N (leggero) e DNA contenente 15 N (pesante). Batteri cresciuti in presenza di 15 N come unica fonte di azoto incorporano 15 N nelle basi puriniche e pirimidiniche del loro DNA (basi azotate) Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

6 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

7 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

8 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

9 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

10 Replicazione nei batteri che hanno DNA circolare (E. coli per es.)

11 L RNA E LA TRASCRIZIONE

12 La Trascrizione La trascrizione comporta la sintesi di una catena di RNA che ha la stessa sequenza di un filamento di una doppia elica di DNA. Il filamento di DNA identico in sequenza all RNA è chiamato filamento codificante il filamento codificante è ovviamente complementare all altro filamento, che funge da stampo per la sintesi dell RNA, ed è chiamato per questa ragione filamento stampo o filamento non codificante. La sintesi della catena di RNA è catalizzata dall enzima RNA polimerasi. La trascrizione comincia quando la RNA polimerasi si lega ad una particolare regione di DNA, chiamata promotore, che si trova all inizio del gene. fa parte della sequenza del promotore la prima coppia di basi trascritta in RNA, chiamata sito di inizio o punto di inizio della trascrizione. Partendo dal sito di inizio, la polimerasi si muove lungo lo stampo sintetizzando l RNA, fino a che non raggiunge una sequenza chiamata terminatore Quest azione definisce l unità di trascrizione, che si estende dal promotore al terminatore; l unità di trascrizione è quindi una sequenza di DNA che viene espressa mediante la sintesi di una singola molecola di RNA una unità di trascrizione può codificare per più di una proteina.

13 Trascrizione Sintesi di RNA a partire da un filamento di DNA stampo. Rappresenta il primo passaggio nel trasferimento dell informazione dal genotipo al fenotipo

14 Molecole di DNA in cui è in corso la trascrizione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

15 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

16 La costituzione a singolo filamento permette alle molecole di RNA di assumere varie conformazioni secondarie. Dato che la struttura determina la funzione, l RNA può svolgere un ampia gamma di mansioni Ribozimi: molecole di RNA ad attività catalitica possibile grazie al fatto che essendo a singolo filamento, la sua struttura secondaria puo variare (nel DNA no perché a doppio filamento). Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

17 Classi di RNA RNA ribosomale assieme alle subunità proteiche costituisce il ribosoma Alcuni snrna partecipano al processo di maturazione dell RNA Gli snorna processano l rrna Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

18 Classi di RNA Classe di RNA Tipo cellulare Localizzazione della funzione Funzione RNA ribosomale (rrna) Batterico ed eucariotico Citoplasma Componenti funzionali e strutturali del ribosoma RNA messaggero (mrna) Batterico ed eucariotico Nucleo e citoplasma Porta il codice genetico per le proteine RNA transfer (trna) Batterico ed eucariotico Citoplasma Aiuta a incorporare gli AA nella catena polipeptidica RNA nucleare piccolo (snrna) Eucariotico Nucleo processamento pre-mrna RNA nucleolare piccolo (snorna) Eucariotico Nucleo processamento e assemblaggio del'rrna RNA piccolo citoplasmatico (scrna) Eucariotico Citoplasma Il loro ruolo funzionale non è stato ancora del tutto chiarito. Uno di questi scrna (RNA 7S) è coinvolto nel processo di importazione cotraduzionale nel reticolo endoplasmatico delle proteine destinate alla secrezione.

19 Le molecole di RNA sintetizzate sono complementari e antiparallele al filamento stampo Lo stampo per la sintesi dell RNA (e anche del DNA) è un singolo filamento della doppia elica di DNA. A differenza della replicazione, la trascrizione interessa solamente uno dei due filamenti, detto filamento stampo. L altro filamento è detto filamento non stampo Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

20 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

21 Un gene viene trascritto da un filamento, ma geni diversi possono essere trascritti da filamenti diversi Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

22 L unità di trascrizione Segmento di DNA che codifica per una molecola di RNA e che contiene le sequenze necessarie alla sua trascrizione. Include 3 regioni: promotore, regione codificante e terminatore Il promotore è la regione del DNA che segnala: 1. quale dei due filamenti di DNA deve essere trascritto 2. qual è il sito di inizio della trascrizione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

23 La trascrizione nei batteri 1. Promotori 2. RNA polimerasi batteriche 3. Terminatori

24 Promotori batterici Hanno sequenze consenso a monte del sito di inizio, a -35 e a -10 La sequenza consenso a -10 è detta anche TATA-box. Essa è situata a circa -10 nei procarioti, e a circa -30 negli eucarioti. È riconosciuta come la regione che facilita l'attacco della RNA polimerasi e sulla quale la RNA polimerasi inizia ad aprire l'elica di DNA. Le basi T ed A sono appaiate in modo da formare solo due legami idrogeno (regola dell'appaiamento delle basi) in questo modo l'enzima RNA polimerasi è in grado di aprire la bolla di replicazione senza grande dispendio energetico. Alcuni promotori batterici contengono un terzo motivo di consenso, chiamato elemento a monte, che contiene un certo numero di coppie A-T e si trova fra -40 e -60

25 Sequenze consenso dei promotori di E. coli Una sequenza consenso è costituita da quei nucleotidi che si incontrano più frequentemente in una determinata posizione Il fattore Sigma si lega a -35 e a -10 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

26 RNA polimerasi batterica Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005 RNA pol batterica costituita da 4 subunità che formano il CORE enzimatico: due ALFA, una BETA e una BETA PRIMO (B ). Il CORE catalizza l allungamento della molecola di RNA mediante l addizione di nucleotidi. Il fattore sigma controlla il legame del Core al promotore. Quando il fattore sigma si attacca al core, formando un oloenzima, la RNA pol si lega stabilmente al promotore e inizia la trascrizione. Dopo la sintesi dei primi nucleotidi il fattore si stacca dato che non è più necessario. Ci sono molteplici fattori sigma: 28,32,54 e 70 sulla base del peso molecolare. Ogni sigma promuove il legame della RNA pol ad una particolare serie di promotori Un enzima privo del cofattore che ne rende possibile l'attività enzimatica è detto apoenzima. Il legame tra cofattore ed apoenzima permette la formazione del cosiddetto oloenzima

27 Nei batteri Sintesi RNA: circa 40 nucleotidi al secondo. Molto piu lenta della sintesi del DNA: 1500 nucleotidi al secondo. La trascrizione avviene all interno di un breve tratto di 18 nucleotidi di DNA svolto: la bolla di trascrizione. In ogni momento 8 nucleotidi di RNA neosintetizzato sono appaiati al DNA stampo Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

28 Terminazione Rho dipendente (attività elicasica che svolge l ibrido RNA-DNA nella bolla di trascrizione) Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

29 Terminatori rho-indipendenti Il terminatore contiene sequenze ripetute invertite cosi che l RNA forma una forcina. Questa forcina rallenta la RNA polimerasi. Seguono 6 A subito dopo la forcina, per favorire il distacco dell RNA dal DNA stampo Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

30 La traduzione nei procarioti Sequenza di Shine-Dalgarno: sequenza del filamento di mrna presso cui il complesso ribosomale dei batteri è in grado di ancorarsi. Tale sequenza permette al ribosoma di posizionarsi correttamente e di iniziare la traduzione con il corretto frame di lettura. Nel 1975 i ricercatori australiani John Shine e Lynn Dalgarno hanno individuato la composizione di tale sequenza (AGGAGG) ed il suo posizionamento immediatamente a monte del codone di inizio (AUG) della traduzione

31 La trascrizione negli eucarioti 1. Promotori 2. RNA polimerasi eucariotiche 3. Processamento (maturazione) dell RNA 4. Terminatori

32 RNA polimerasi negli eucarioti RNA polimerasi I RNA polimerasi II RNA polimerasi III rrna (rrna28s, 18S, 5.8S) pre-mrna, snorna e alcuni snrna trna, piccoli rrna, snrna Trascrizione ad opera dei fattori di trascrizione + RNA pol Promotori, enhancer, soppressori

33 Le RNA polimerasi negli eucarioti La RNA polimerasi I sintetizza gli rrna28s, 18S, 5.8S Per terminare la trascrizione la RNA pol I richiede un fattore di terminazione che si lega al DNA a valle del sito di terminazione bloccando l avanzamento della RNA pol La RNA polimerasi II sintetizza gli mrna, gli snornae alcuni snrna La RNA pol II continua a trascrivere anche a valle del 3 del gene. L estremità 3 del trascritto viene determinata da un taglio effettuato da un complesso enzimatico specifico La RNA polimerasi III sintetizza l rrna5s, i trnae alcuni snrna La RNA pol III termina la trascrizione dopo avere trascritto una fila di U che destabilizzano l ibrido DNA-RNA I fattori di trascrizione sono una classe di proteine accessorie che unitamente alle RNA polimerasi costituiscono l apparato basale della trascrizione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

34 L inizio della trascrizione negli eucarioti Sono coinvolte due grandi classi di sequenze di DNA: I promotori Sono sempre adiacenti al gene che regolano, e mostrano una localizzazione fissa rispetto al punto di inizio della trascrizione Gli enhancer Non sono necessariamente adiacenti al gene che regolano, e la loro localizzazione rispetto al punto di inizio della trascrizione può variare

35 I promotori eucariotici Y: T or C (pyrimidine) N: G,A,T,C Nei promotori eucariotici sono presenti diverse sequenze consenso Non tutte le sequenze mostrate si rilevano in qualsiasi promotore TFIIB è un fattore di trascrizione. Al posto del TATA box, alcuni promotori possiedono un elemento iniziatore (Inr). Questi, generalmente possiedono anche un elemento 30 basi a valle del promotore (DPE: downstream promoter element). Tutte queste sequenze sono riconosciute da fattori di trascrizione che si legano ad esse e che fungono da supporto per l assemblaggio dell apparato trascrizionale Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

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37 TFIID è il fattore generale che riconosce il core promoter. Sui promotori riconosciuti dalla RNApol II, la trascrizione inizia con il legame del fattore trascrizionale TFIID al TATA box, cui segue il legame dell oloenzima preassemblato che contiene fattori di trascrizione generali e da un complesso di proteine noto come mediatore Il promotore regolativo è localizzato immediatamente a monte del core promoter e contiene una vasta gamma di sequenze consenso differenti, attivatori o repressori Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

38 Some transcription factors ("Enhancer ) bind to regions of DNA that may be even thousands of base pairs away from the gene they control. Binding increases the rate of transcription of the gene. Enhancers can be located upstream, downstream, or even within the gene they control. How does the binding of a protein to an enhancer regulate the transcription of a gene thousands of base pairs away? One possibility is that enhancer- in addition to their DNA-binding site, have sites that bind to transcription factors ("TF") assembled at the promoter of the gene. This would draw the DNA into a loop (as shown in the figure). Enhancers can work even if their normal 5' to 3' orientation is flipped Enhancers can work even if they are moved to a new location Regulatory sequences with similar characteristics, but the opposite effect, exist. These are called silencers.

39 Terminazione Terminazione della trascrizione è meno compresa che nei procarioti Le differenti RNA polimerasi eucariotiche utilizzano meccanismi diversi per la terminazione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

40 Processamento dell mrna eucariotico 1. Aggiunta del cappuccio all estremità 5 2. Aggiunta della coda di polia all estremità 3 3. Rimozione degli introni e giunzione degli esoni Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

41 Aggiunta del cap in 5 Subito dopo l inizio della trascrizione, la 7- metilguanina è aggiunta all estremità 5 del trascritto attraverso un legame covalente 5-5 Il cappuccio serve: -a proteggere l mrna dalla degradazione -a posizionare correttamente l mrna sui ribosomi Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

42 Aggiunta della coda poli A La lunghezza della coda di poli A aggiunta varia tra le 50 e le 200 adenine La coda di poli A conferisce stabilità agli mrna, aumentandone la vita media Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

43 Gene della distrofina Localizzato sul cromosoma X Gene basi Proteina AA = basi Per quale motivo è così voluminoso?

44 Concetto di COLINEARITA : corrispondenza diretta DNAproteina Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

45 Gli introni Gli introni sono sequenze di un gene che vengono trascritte ma che vengono rimosse durante la maturazione dell RNA. Esse quindi non sono tradotte in proteine Negli eucarioti la sequenza di un gene contenente introni e quella del suo mrna maturo non sono colineari Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

46 Gli INTRONI Sono presenti quasi esclusivamente nei geni eucariotici Variano per numero (nell uomo da 0 a 60) Variano per lunghezza (da 200 fino a nucleotidi) Sono in genere più lunghi degli esoni Negli eucarioti superiori il numero medio di introni per gene aumenta all aumentare della complessità degli organismi Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

47 Lo splicing avviene nel nucleo Y = pirimidina, R= purina, N= qualsiasi base, A= adenina. Punto di ramificazione: A presente fra 18 e 40 basi dallo splicing 3 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

48 L RNA messaggero: Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

49 Gene pre-mrna mrna Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

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51 Da una molecola di pre-mrna si possono ottenere diverse molecole di mrna maturo in seguito a combinazioni diverse degli esoni Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

52 Da una molecola di pre-mrna si possono ottenere diverse molecole di mrna maturo in seguito a combinazioni diverse degli esoni Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

53 Pre-mRNA codificato dal gene della calcitonina Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

54 EDITING dell RNA Osservato per la prima volta nel 1986 quando si è visto che la sequenza dell RNA differiva da quella del DNA stampo. Avviene o mediante RNA guida o mediante la deaminazione della citosina, che genera uracile. RNA guida Deaminasi (C->U) Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

55 Differenze nella trascrizione tra procarioti ed eucarioti Procarioti 1. Un unico tipo di RNA polimerasi 2. L mrna viene tradotto mentre la trascrizione è in corso 3. I geni non sono interrotti 4. Gli mrna sono spesso policistronici Eucarioti 1. Tre diverse RNA polimerasi 2. L mrna viene maturato, trasportato nel citoplasma e poi tradotto 3. I geni contengono introni ed esoni 4. Gli mrna sono monocistronici

56 I geni Un gene - un carattere Un gene - un enzima Un gene - una proteina Un gene - un polipeptide Gregor Mendel; seconda metà dell 800 Archibald Garrod; prima metà del 900 George Beadle ed Edward Tatum (+ subunità per alcuni enzimi) Un gene - un RNA Il gene è l unità di trascrizione, costituita da un segmento di DNA che codifica per una molecola di RNA e dalle sequenze necessarie alla sua trascrizione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

57 Il gene è l'unità Nuovo ereditaria degli concetto organismi viventi. gene I geni sono contenuti nel genoma di un organismo, che può essere composto di DNA o di RNA, e dirigono lo sviluppo fisico e comportamentale dell'organismo. La maggior parte dei geni codifica proteine, che sono le macromolecole maggiormente coinvolte nei processi biochimici e metabolici della cellula. Molti geni non codificano proteine, ma producono RNA non codificante, che può giocare un ruolo fondamentale nella biosintesi delle proteine e nell'espressione genica. A modern working definition of a gene is "a locatable region of genomic sequence, corresponding to a unit of inheritance, which is associated with regulatory regions, transcribed regions, and or other functional sequence regions Rather than striving to reach a single definition and coming to blows in the process most geneticists are instead incorporating less ambiguous words into their vocabulary such as transcripts and exons. When it is used, the word 'gene' is frequently preceded by 'protein-coding' or another descriptor. (

58 IL CODICE GENETICO E LA TRADUZIONE

59 Le molecole richieste per la traduzione mrna Ribosomi trna + aa Enzimi vari

60 I Ribosomi I ribosomi sono formati da tre molecole di RNA ribosomale e da proteine che si associano a formare due subunità. Il ribosoma batterico ha una massa di circa 2700 kda ed un coefficiente di sedimentazione di 70 S. Esso si può suddividere in due parti o subunità, una più grande di 50 S ed una più piccola di 30 S: la subunità grande di 50 S è costituita da almeno 34 proteine (L1-L34) e due molecole di RNA (23 S e 5 S), la subunità piccola di 30 S è costituita da almeno 21 proteine (S1-S21) ed un RNA di 16 S. Il ribosoma eucariote (fatta eccezione per quelli contenuti nei mitocondri e nei cloroplasti) ha una massa molecolare di 4000 kda ed un coefficiente di sedimentazione di 80 S. Anch'esso è composto da due subunità, maggiore di 60 S e minore di 40 S: la subunità maggiore è costituita da tre molecole di rrna, una di 28 S, una di 5,8 S e un'ultima di 5 S. la subunità minore è costituita di una sola catena di RNA 18 S. Nel complesso le due subunità presentano più di 80 proteine.

61 I Ribosomi rrna Proteine Subunità Ribosomi assemblati

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65 The translation apparatus cannot go past a nonsense codon (UAG in this case), because there is no trna that can recognize the UAG triplet. This leads to the termination of protein synthesis and to the subsequent release of the polypeptide fragment

66 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

67 Solo quando una proteina assume la sua corretta struttura tridimensionale, o conformazione, e in grado di funzionare efficacemente. La funzione dipende dalla struttura tridimensionale e la struttura tridimensionale e determinata dalla sequenza aminoacidica Tutte le proteine presentano ad un estremita un gruppo aminico libero ( NH 2 ) (estremità N-terminale) e all altra un gruppo carbossilico libero (-COOH) (estremità C- terminale). Le catene polipeptidiche si accrescono per aggiunta di singoli residui aminoacidici a partire dalla metionina N- terminale fino all estremo C-terminale. Spesso enzimi proteolitici eliminano poi questa metionina.

68 Alcune proteine sono costituite da subunità codificate da geni diversi Ipotesi un gene un enzima -> un gene un polipeptide

69 Le caratteristiche del CODICE GENETICO Il codice genetico rappresenta la corrispondenza fra una serie di sequenze di 3 nucleotidi e gli specifici aminoacidi. Quasi tutti gli esseri viventi usano il medesimo codice genetico, chiamato codice genetico standard. La sequenza di nucleotidi dell mrna si legge in gruppi di tre basi ciascuno, chiamati codoni. Ad ogni codone corrisponde uno specifico aminoacido, si dice quindi che il codone codifica per quell'aminoacido. Il codice genetico è: Degenerato Non sovrapposto Universale (o quasi)

70 CODICE DEGENERATO 20 aminoacidi 64 possibili codoni Ogni amminoacido è codificato da una sequenza di tre nucleotidi consecutivi detta codone. Il codice genetico è costituito da 64 codoni, di cui 61 sono senso, ossia corrispondono ad amminoacidi, e 3 codoni sono non senso: segnali di terminazione della traduzione Degenerato significa che gli aminoacidi possono essere codificati da più di un codone (codoni sinonimi). Solo il triptofano e la metionina sono codificati da una sola tripletta Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

71 Il vacillamento Ci sono trna diversi nelle cellule, ma 64 triplette possibili: vacillamento. Es. Alanina codificata da GC + U,A,C o G. I legami a idrogeno delle prime due basi sono forti abbastanza da permettere un appaiamento non convenzionale sulla terza base Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

72 CODICE NON SOVRAPPOSTO Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

73 Il codice genetico è (quasi) UNIVERSALE Il codice genetico per il DNA cromosomale e universale, cioè, è comune dai procarioti piu semplici agli eucarioti piu complessi. Fa parzialmente eccezione il DNA mitocondriale nel quale il codone UGA viene letto come Triptofano (invece che stop) e il codone AUA come Metionina (invece che Isoleucina).

74 Il codice genetico è (quasi) universale

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77 Negli eucarioti, l mrna prodotto nel nucleo è trasportato nel citoplasma per la traduzione

78 Il DNA contenuto negli organelli cellulari DNA mitocondriale DNA cloroplastico Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

79 I genomi degli organuli Piccoli, ma essenziali Elevato numero di copie Organizzati in complessi nucleoproteici (nucleoidi) Eredità non mendeliana Informazione genetica necessaria ma non sufficiente per la completa funzionalità dell organulo Interazione fra i sistemi genetici degli organuli e del nucleo. Per es., geni per molte proteine ed enzimi strutturali dei mitocondri sono in realtà codificati da DNA nucleare, tradotti dai ribosomi e trasportati nei mitocondri

80 DNA mitocondriale umano bp Codifica per 37 geni (che codificano per 13 proteine, 22 trna e 2 rrna), coinvolti nella produzione di proteine necessarie alla respirazione cellulare Le mutazioni del DNA mitocondriale possono portare ad un gran numero di malattie, tra le quali l'exercise intolerance e la sindrome di Kearns- Sayre (KISS), che causa la perdita della piena funzionalità nei movimenti di cuore, occhi e muscoli. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

81 DNA mitocondriale di lievito bp Codifica per 2 rrna, 25 trna e 16 proteine Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

82 DNA cloroplastico IL GENOMA CLOROPLASTICO kbp Due sequenze ripetute invertite (6-76 kbp), assenti nelle Conifere e alcune Leguminose Circa 100 geni suddivisi in due gruppi: Geni per trascrizione, traduzione Geni per le proteine dei complessi delle membrane tilacoidali Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

83 Omoplasmia ed eteroplasmia Si definisce eteroplasmia la coesistenza di diversi genomi mitocondriali (un genoma "selvatico" o "wild-type", cioè senza mutazioni, ed uno o più genomi mutati) all'interno dei mitocondri di cellule diverse (eteroplasmia intercellulare) o, addirittura, all'interno di una stessa cellula (eteroplasmia intracellulare). Si definisce omoplasmia la presenza, all'interno di una cellula, del solo DNA mitocondriale normale o del solo DNA mitocondriale mutato. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

84 Eredità materna Virtualmente tutti i mitocondri dello zigote derivano dall oocita e perciò la modalità di trasmissione delle mutazioni mt differisce dalla trasmissione mendeliana classica: madre portatrice trasmissione a tutta la progenie, ma solo le figlie femmine possono trasmettere la mutazione ai loro figli. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

85 I mitocondri contenuti nello sperma dei mammiferi non entrano nella cellula uovo, in quanto le modalità di penetrazione dello spermatozoo e la costituzione anatomica dello stesso consentono l'ingresso della sola testa, pertanto i mitocondri che hanno sede nel corpo non vengono inseriti. In alcuni casi alcuni mitocondri paterni possono penetrare tuttavia vengono distrutti dalla cellula uovo subito dopo la fecondazione. In rari casi i mitocondri possono essere ereditati dal padre, ad esempio nelle banane L'ipotesi che il DNA mitocondriale umano fosse ereditato dalla madre, spinse i ricercatori a tracciare la linea uterina già molto tempo fa (anche il cromosoma Y, ereditato dal padre, viene utilizzato in un modo analogo per studiare la linea maschile). Questo è completato, negli esseri umani, dal sequenziamento di una o più regioni ipervariabili (HVR1 o HVR2) del mtdna. Il tentativo della teoria dell'eva mitocondriale di scoprire l'origine dell'umanità si basa sullo stesso tipo di analisi. In particolare, studi sul DNA mitocondriale umano hanno permesso al genetista inglese Bryan Sykes di chiarire le modalità con cui le popolazioni agricole si sono diffuse dal Medio oriente all'europa preistorica popolata da cacciatori raccoglitori, oltre all'origine delle popolazioni polinesiane, dimostrata essere nel sud est asiatico: questi e molti altri risultati della tecnica del mtdna sono esposti nel volume "Le sette figlie di Eva. Le comuni origini genetiche dell'umanità". Saggi Mondadori 2003.

86 MUTAZIONI GENICHE Pierce: per mutazione si intende il cambiamento dell informazione genetica che viene ereditato (? No way!). Per mutazione genetica si intende ogni modifica stabile ed ereditabile nella sequenza nucleotidica di un genoma o più generalmente di materiale genetico Mutazioni somatiche Mutazioni della linea germinale Nel corpo umano vi sono circa cellule, freq mutazione 1 ogni c.a divisioni

87 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

88 MUTAZIONI PUNTIFORMI Per mutazione si intende la modificazione della sequenza codificante di un gene. Sostituzioni: quando una base viene sostituita da un altra Inserzioni: aggiunta di una o più basi Delezioni: rimozione di una o più basi

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90 Transizione e Trasversione Le mutazioni per sostituzione di basi sono dette transizioni quando una purina è sostituita da un altra purina o una pirimidina è sostituita da un altra pirimidina; sono dette trasversioni quando una purina è sostituita da una pirimidina o viceversa.

91 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

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95 InDel in fase se riguarda intere triplette Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

96 Espansione della ripetizione di trinucleotidi Causa mutazioni in FMR-1, responsabile della sindrome del cromosoma X fragile (causa del ritardo mentale) ripetizione di CGG: 60 ripetizioni nel normale, centinaia/migliaia nel mutato La Sindrome dell X-Fragile è la causa di ritardo mentale ereditario più frequente. Circa 1:4000 maschi nella popolazione generale sono affetti dalla sindrome. E meno frequente nelle femmine: infatti queste ultime possedendo 2 cromosomi X hanno anche una copia del gene che può funzionare correttamente. Lo sviluppo mentale delle persone affette da FraX è molto vario. Alcune mostrano capacità cognitive quasi normali, altre un lieve ritardo mentale, altre ancora un ritardo mentale più grave. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

97 Lo slittamento dei filamenti durante la replicazione è alla base dell espansione della ripetizione dei trinucleotidi Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

98 EFFETTI FENOTIPICI DELLE MUTAZIONI PUNTIFORMI

99 Mutazione in avanti: altera il fenotipo selvatico Mutazione inversa: (retromutazione): ripristina il fenotipo selvatico Mutazione soppressiva: rispristina il fenotipo selvatico con una seconda mutazione Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

100 Mutazione soppressiva intragenica E una mutazione (v.) che sopprime il fenotipo dovuto ad un altra mutazione, così che le due insieme danno luogo ad un fenotipo normale. Entrambe le mutazioni sono a carico dello stesso gene Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

101 Mutazione soppressiva intergenica The amber mutation (Alteration of a codon to UAG, one of the three codons that result in premature polypeptide chain termination in all living organism) replaces a wild-type codon with the chain-terminating nonsense codon UAG. The suppressor mutation in this case produces a trna Tyr with an anticodon that recognizes the mutant UAG stop codon. The suppressed mutant thus contains tyrosine at that position in the protein. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

102 Mutazione nonsenso (amber): mutazione puntiforme che converte un codone qualsiasi in un codone di stop e quindi si produce l interruzione prematura della catena polipeptidica. A volte può essere eliminata da geni soppressori che codificano per trna mutanti. Affinche le cellule sopravvivano devono pero essere presenti anche i trna normali. Mutazione missenso: a seguito di una sostituzione nucleotidica viene codificato un aminoacido differente. La funzione della proteina può però non essere compromessa (mutazione neutra) Mutazione silente: la sostituzione nucleotidica non varia l aminoacido codificato (codice degenerato)

103 Mutazione neutra: a seguito di una sostituzione viene inserito un aminoacido differente senza però alterare la funzionalità della proteina Mutazione con perdita di funzione: recessiva, altera il fenotipo selvatico Mutazione con acquisto di funzione: dominante, altera il fenotipo selvatico Mutazione condizionale: espressa solo in determinate condizioni Mutazione letale: causa la morte

104 Cause delle mutazioni Mutazioni spontanee: dovute a cambiamenti naturali nella struttura del DNA Mutazioni indotte: causate da agenti chimici (bromuro di etidio, UV) o radiazioni

105 Tasso di mutazione Frequenza con cui il gene cambia da tipo selvatico a mutante. E espressa come numero di mutazioni per unità biologica (divisone cellulare, gamete o ciclo di replicazione. Es. 1 ogni gameti) Frequenza di mutazione Incidenza di un tipo specifico di mutazioni all interno di un gruppo di organismi (es. 1 persona su )

106 Il test di Ames The Ames test uses a battery of strains of Salmonella typhimurium, all of which carry a different kind of mutation in the histidine (his) biosynthetic pathway. Hence these strains of Salmonella are auxotrophs because they require the amino acid histidine in the medium in order to grow. The mutations that affects the his gene are a variety of in-frame mutations (such as base-pair substitutions) and frameshift mutations (such as base-pair deletions or insertions). Since there is always a low level of mutations occurring these strains can revert to his + at a low frequency (back to its prototroph). This type of reversion is called a back mutation. If cells are exposed to a mutagen, the frequency of mutation increases. Hence one can easily measure the frequency of reversion of Salmonella typhimurium from his- to his+ to determine if an unknown chemical is a possible mutagen. A mutagen will increase the frequency of reversion Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

107 From The RED BOOK BULLETIN of Current Protocols in Molecular Biology: