Tassonomia microbica e filogenesi

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1 Tassonomia microbica e filogenesi

2 Tassonomia: la scienza della classificazione biologica La tassonomia si articola in tre suddivisioni: classificazione nomenclatura identificazione La classificazione consiste nell ordinamento degli organismi in gruppi, definiti in base alle reciproche somiglianze e alle relazioni evolutive. La nomenclatura è il ramo della tassonomia che assegna ai vari gruppi tassonomici un nome, secondo norme ben definite. L identificazione è il settore pratico della tassonomia: è il processo che permette di stabilire se un determinato isolato appartiene ad un determinato gruppo.

3 Classificazione dei batteri Si basa essenzialmente sulla identificazione dei generi e delle specie. Le principali tecniche utilizzate per differenziare le varie specie sono: la TASSONOMIA NUMERICA: classificare vengono analizzati valutati una serie di caratteri, comparandoli tra loro. l ANALISI GENETICA: 1. Valutazione della percentuale in G+C. 2. Grado d ibridazione del DNA. l ANALISI DELLE SEQUENZE: 1. Sequenza aminoacidica delle proteine. 2. Sequenza nucleotidica delle molecole di RNA. e e

4 Origine delle specie cellulari

5 Adattamento del sistema classificativo ai cinque regni Animalia Plantae Monera (Procaryotae) Fungi Protista

6 Ordinamento tassonomico Nel classificare un gruppo biologico si è soliti raggruppare gli individui in categorie di ordine progressivamente superiore. I livelli di comune impiego sono: specie, genere, famiglia, ordine, classe, divisione o phylum e regno. Tale ordinamento viene detto gerarchico poiché ogni categoria della serie ascendente riunisce un numero sempre maggiore di unità tassonomiche con un numero progressivamente più piccolo di proprietà comuni.

7 Il concetto di Specie La specie rappresenta l unità tassonomica fondamentale In generale una specie è costituita da un insieme di individui (o, nel caso dei microrganismi, di popolazioni clonali) che hanno in comune un elevato grado di somiglianza fenotipica, unita ad un apprezzabile diversità da altri insiemi dello stesso tipo.

8 La definizione di Specie Nel caso delle piante e degli animali che si riproducono sessualmente, una specie può essere definita in termini genetici ed evoluzionistici. La specie è un particolare stadio evolutivo in cui linee che si incrociavano o che erano potenzialmente in grado di incrociarsi si sono separate in due o più linee fisiologicamente incapaci di incrociarsi.

9 Il concetto di specie in microbiologia Quando si parla di microrganismi, che per la maggior parte sono apolidi e si riproducono prevalentemente per via asessuata, il concetto di specie qual è emerso da studi con piante ed animali risulta evidentemente inadeguato. L esperienza dei tassonomi dei microrganismi ha tuttavia dimostrato che dopo un accurata analisi molti ceppi appartenenti ad un determinato gruppo microbico possono essere generalmente divisi in una serie di gruppi discontinui; sono appunto questi gruppi di ceppi che il tassonomo definisce empiricamente come specie.

10 Il concetto di specie in microbiologia La migliore definizione funzionale attualmente disponibile è la seguente: una specie batterica è costituita da un gruppo di ceppi che mostrano un grado elevato di somiglianza fenotipica e che si distinguono da altri gruppi di ceppi correlati per un grande numero di caratteri indipendenti Ceppo: popolazione di organismi che discende da un unico microrganismo o da un isolato in coltura pura.

11 Nomenclatura delle specie: il sistema binomiale Ogni specie biologica viene indicata con un nome latino composto di due parole. La prima indica il genere a cui la specie appartiene, mentre la seconda la identifica come una specie particolare di quel genere. La prima lettera del nome generico viene scritta con il carattere maiuscolo e l intera denominazione è scritta in corsivo: Escherichia (nome del genere) coli (nome della specie). Nei casi in cui non esiste pericolo di fare confusione, il nome generico viene spesso abbreviato alla sola lettera iniziale: E. coli.

12 Nomenclatura delle specie La nomenclatura biologica è regolata dalle regole del Codice Batteriologico, una serie rigida e complessa di norme destinate a mantenerla il più possibile stabile. Non si può cambiare il nome specifico assegnato ad una specie di nuova scoperta a meno che non si possa dimostrare che quell organismo era già stato descritto prima con un altro nome specifico, nel qual caso deve essere usato con priorità il vecchio nome. Il nome generico non è protetto dalla stessa stabilità, perché l ordinamento di specie affini in generi è un operazione che può essere eseguita in modi diversi e che spesso cambia col tempo man mano che vengono acquisite nuove informazioni. In passato per esempio E. coli era stato incluso nel genere Bacterium come Bacterium coli e nel genere Bacillus come Bacillus coli.

13 Il Bergey s Manual of Systematic Bacteriology Il principale trattato di tassonomia dei procarioti è il Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, un trattato in quattro volumi che contiene il sistema tassonomico batterico attualmente accettato e offre ai microbiologi sia i fondamenti che i dettagli delle attuali conoscenze della tassonomia e della filogenesi microbica. Non è un trattato ufficiale, ma rappresenta solo un consenso generale, la prima fonte consultata dagli esperti di tassonomia per caratterizzare un procariote di recente isolamento.

14 Il ceppo tipo Quando si isola un nuovo microrganismo bisogna decidere se esso sia sufficientemente diverso da altre specie da essere considerato come nuovo. Al fine di ottenere il riconoscimento tassonomico formale come nuova specie sono pubblicati una dettagliata descrizione dell organismo isolato e il nome proposto, mentre una coltura vitale dell organismo è depositata in due collezioni. Il ceppo depositato diviene il ceppo tipo della nuova specie e lo standard con il quale verranno confrontati gli altri ceppi ritenuti uguali. Il ceppo tipo è importante ai fini della classificazione poiché solo i ceppi che hanno in comune un elevato grado di somiglianza con il ceppo tipo vengono inclusi in una determinata specie.

15 Sistemi di classificazione I primi sistemi di classificazione biologica avevano una struttura artificiale. Col progredire delle conoscenze sull anatomia delle piante e degli animali, divenne evidente che questi organismi possono essere ordinati in numerosi modelli o tipi principali. Il primo sistema di classificazione biologica che tentò di raggruppare gli organismi secondo queste somiglianze e differenze tipologiche fu messo a punto da Linneo (sistema di classificazione naturale). Quando venne riconosciuto il processo dell evoluzione biologica, il concetto di classificazone naturale acquisì immediatamente un altra dimensione. Nel diciannovesimo secolo cambiò di conseguenza il concetto di sistema naturale e gli organismi furono raggruppati a seconda delle loro affinità evolutive (classificazione filogenetica).

16 La classificazione filogenetica Una classificazione filogenetica cataloga insieme le specie correlate filogeneticamente, ossia le specie che hanno ancestori comuni. La dimostrazione di relazioni filogenetiche negli esseri superiori è grandemente facilitata dall esistenza di resti fossili di ancestori comuni a più specie e dalla moltitudine dei caratteri morfologici che si possono studiare. Questo sistema di classificazione è, però, inadeguato per i batteri perché non è agevole il ritrovamento di fossili e le proprietà morfologiche che si possono studiare sono poche. La classificazione dei batteri non può che essere artificiale, ossia una classificazione che raggruppa insieme i batteri con un certo numero di caratteristiche in comune.

17 Tassonomia numerica Esiste un sistema alternativo empirico che tenta di basare l ordinamento tassonomico sulla quantificazione delle somiglianze e delle differenze tra gli organismi. Questo sistema fu suggerito per la prima volta dal botanico Michel Adanson, e per questo motivo si chiama tassonomia adansoniana o numerica. Essa si basa sul presupposto che, valutando alla stessa stregua ciascun carattere fenotipico, è possibile esprimere numericamente le distanze tassonomiche fra gli organismi, basandosi sul numero di caratteri comuni rispetto al numero totale di caratteri esaminati.

18 Tassonomia numerica il coefficiente di accoppiamento semplice (SSM) include nel calcolo sia le coppie positive che quelle negative. il coefficiente di similarità di Jaccard (SJ) si basa solo sulle coppie positive. il valore di entrambi i coefficienti varia da 0 (nessuna condivisione) a 1 (100% di condivisione).

19 Tassonomia numerica I coefficienti di accoppiamento sono disposti in modo da formare una matrice di similarità Gli organismi con livelli elevati di similarità (fenoni) vengono raggruppati insieme e separati da quelli dissimili I risultati di quest analisi sono rappresentati da un dendrogramma

20 Tassonomia numerica L ordinata di un dendrogramma non ha alcuna particolare importanza e i gruppi di batteri possono essere disposti nella forma più conveniente

21 Principali caratteristiche impiegate nella tassonomia Caratteristiche morfologiche Caratteristiche fisiologiche e metaboliche Caratteristiche ecologiche Analisi genetica Caratteristiche molecolari

22 Nuovi approcci alla tassonomia Composizione in basi del DNA batterica Ibridazione degli acidi nucleici Sequenziamento degli acidi nucleici

23 Composizione in basi del DNA La temperatura di fusione del DNA è direttamente proporzionale al suo contenuto in G+C.

24 Composizione in basi del DNA La separazione dei filamenti è accompagnata da un aumento dell assorbanza a 260nm; tale misura può essere eseguita con uno spettrofotometro. Quando un campione di DNA viene gradualmente riscaldato, l assorbanza aumenta via via che si rompono i legami a idrogeno fino a raggiungere un massimo a una temperatura alla quale tutto il DNA è denaturato. Il punto medio di quest aumento viene chiamato temperatura di fusione (T m : melting temperature) e fornisce una misura del contenuto in GC del DNA.

25 Composizione in basi del DNA Sia nelle piante che negli animali il contenuto in GC è piuttosto simile con variazioni piccole e si aggira ad un valore intorno al 35-40%. Nei protisti le variazioni sono molto più ampie, ma le massime variazioni si registrano tra i procarioti in cui il contenuto in GC varia dal 25 a quasi l 80%.

26 Composizione in basi del DNA Il contenuto medio in GC in ceppi diversi appartenenti ad una singola specie batterica è molto simile Ogni specie batterica ha nel suo DNA un contenuto medio caratteristico di GC che è uno dei suoi caratteri specifici più importanti. Una sostanziale divergenza tra due organismi riguardo la composizione media in basi del loro DNA può essere considerata la prova di una importante divergenza genetica e quindi di un ampia separazione evolutiva. L ampio spettro di valori caratteristico dei procarioti rivela di conseguenza la grande diversità evolutiva di questo gruppo biologico e la sua antica origine.

27 Composizione in basi del DNA Due organismi con identica composizione in basi del DNA possono differire in modo consistente nella costituzione genetica; ciò è evidente dai valori molto simili del rapporto fra le basi del DNA di tutti gli animali e di tutte le piante. Quando due organismi sono molto simili nella composizione in basi del loro DNA, si può interpretare questo fatto come una indicazione di una parentela genetica solo se gli organismi condividono anche un ampio numero di proprietà fenotipiche. In tal caso la quasi identità della composizione in basi del DNA fornisce una prova evidente della loro relazione genetica ed evolutiva. Nel caso dei batteri in cui lo spettro di variazione è così ampio, la composizione media in basi del DNA ha un particolare valore tassonomico ed è particolarmente utile nella definizione di genere poichè l intervallo di variabilità all interno di un genere è generalmente inferiore al 10%, anche se può variare ampiamente tra i vari generi.

28 Ibridazione degli acidi nucleici Se una soluzione di DNA a singolo filamento viene raffreddata e mantenuta ad una temperatura di circa 20 C al di sotto della Tm, si verifica una specifica riassociazione dei filamenti. C è sempre qualche appaiamento casuale, ma poiché una doppia elica riunita a caso contiene molte basi appaiate male, la sua termostabilità è bassa e i suoi filamenti si separano molto rapidamente ad una temperatura vicina alla Tm. L appaiamento di filamenti complementari, invece, forma doppie eliche che sono molto stabili. Così a temperature prossime al valore di Tm si mantengono solo le doppie eliche tra i filamenti con un elevato grado di complementarietà

29 Ibridazione degli acidi nucleici Mescolando e sottoponendo a questo trattamento preparazioni di DNA ottenute da due ceppi affini di batteri si formano molecole di DNA ibrido. Se le molecole di DNA differiscono notevolmente nella sequenza delle basi, esse non saranno in grado di formare un ibrido stabile L ibridazione DNA-DNA viene utilizzata solo per studiare i microrganismi strettamente affini.

30 Ibridazione degli acidi nucleici La gamma di organismi tra i quali si può riscontrare omologia genetica può essere ampliata mediante studi sulla riassociazione DNA-rRNA. Spesso è possibile trovare, mediante associazione rrna-dna, un omologia relativamente elevata tra i genomi di due organismi che non mostrano, invece, un omologia significativa tramite la riassociazione DNA-DNA.

31 Sequenziamento degli acidi nucleici Finora l applicazione di queste tecniche per affrontare problemi tassonomici è stata minima, ma non c è dubbio che per determinare le relazioni tra organismi occorre dipendere dal confronto delle sequenze in basi del DNA. Non è irrealistico che in un prossimo futuro, quando saranno disponibili le sequenze complete di molti microrganismi, la tassonomia diventi una scienza esatte e quantitativa.

32 rrna 16S e filogenesi batterica L attenzione maggiore è stata rivolta soprattutto alle sequenze degli rrna 16S dei ribosomi batterici. Esiste un accordo generale sul fatto che il grado di somiglianza nella sequenza di questa molecola rifletta la distanza filogenetica tra organismi. A causa delle restrizioni cui è soggetta la struttura dell rrna, come conseguenza del fatto che deve assumere una struttura secondaria definita e deve interagire con diverse proteine per formare un ribosoma funzionale, il tasso di variazione delle sequenze dei geni che codificano per l rrna è di gran lunga inferiore a quello degli altri geni; di conseguenza è possibile determinare le relazioni filogenetiche su ampie distanze evolutive. Questo tipo di RNA funziona, quindi, come un orologio molecolare e consente accurate determinazioni delle distanze filogenetiche.

33 Classificazione degli esseri viventi sulla base delle sequenze dell RNA ribosomiale

34 eubatteri ed archebatteri Il confronto delle sequenze dell rrna 16S evidenziò come tale molecola di metanogeni, alofili e termoacidofili fosse inaspettatamente divergente da quello degli altri batteri. Fu così che si identificò il gruppo degli archebatteri come separato dagli altri procarioti. Sulla base degli studi filogenetici sono riconoscibili due gruppi di batteri dalla parentela molto lontana. Gli eubatteri comprendono la grande maggioranza di batteri che sono reperibili nelle acque, nel suolo, e negli organismi viventi superiori. Possiedono peptidoglicano che contiene acido muramico e lipidi di membrana simili ai lipidi di membrana degli eucarioti. Gli archebatteri differiscono per molti aspetti dagli eubatteri, mentre risultano simili agli eucarioti per altre caratteristiche. Non hanno acido muramico nella loro parete ed hanno lipidi di membrana dotati di catene alifatiche ramificate.

35 Albero filogenetico universale

36 Sistema di classificazione degli esseri viventi in cinque regni proposto da Wittaker