Enorme e` l`importanza dell`analisi delle sequenze degli acidi nucleici e delle proteine nello studio e nella comprensione della loro funzione.

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1 Enorme e` l`importanza dell`analisi delle sequenze degli acidi nucleici e delle proteine nello studio e nella comprensione della loro funzione. In generale la sequenza primaria di una macromolecola determina la sua struttura tridimensionale, anche se sono state identificate una serie di proteine, note come chaperonine, necessarie per il ripiegamento delle proteine in una corretta struttura terziaria. Non esistono procedure affidabili per la determinazione della struttura terziaria (folding) di una proteina a partire dalla sua sola sequenza. Piu` di strutture cristallografiche => piu` di sequenze proteiche. L`analisi della struttura tridimensionale aiuta a comprendere in quale modo e per quale motivo una determinata sequenza possa codificare una ben precisa funzione.

2 Metodi classici per la determinazione della struttura proteica Determinare la struttura di una macromolecola significa determinare la posizione dei sui atomi. Due sono i metodi classici: Cristallografia a raggi X: La proteina cristallizzata viene colpita con una sorgente di raggi X=> vengono generate delle figure di difrazione, generate dall`interazione tra i raggi X e gli atomi delle proteine del cristallo. L`analisi della figura porta alla formazione di mappe di densita` elettronica che consentono di costruire modelli tridimensionali della proteina. Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (Nuclear Magnetic Resonance, NMR): Si basa sulle propieta` quanto-magnetiche della materia immersa in campi magnetici. L`ambiente locale influenta il modo in cui gli atomi rispondono ai campi magnetici. Interazione tra gli atomi non legati tra loro ma posti a distanze inferiori ai 5 Å. Opera non su cristalli ma su soluzioni.

3 PDB (Protein Data Bank) Prima banca dati di strutture di interesse biologico: Strutture proteiche (complessi proteici, capsidi virali, cofattori, substrati, inibitori o altri ligandi), che rappresentano quasi il 90% dei dati. Complessi di proteine con acidi nucleici (fattori di trascrizione legati al DNA e i ribosomi), che comprendo circa il 4% dei dati. Strutture di acidi nucleici, circa il 6% dei dati Strutture di carboidrati

4 Alcune proteine presenti in PDB sono state risolte sia per difrazione ai raggi X sia tramite NMR, alcune sono presenti sia nella loro forma libera sia co-cristallizzati con altri ligandi. Di alcune proteine sono presenti diversi file di coordinate, che descrivono mutanti che spesso mantengono la stessa struttura tridimensionale => ridondante! Un record di PDB e` identificato da 4 caratteri, un numero e tre caratteri. Il numero rappresenta la versione del record, le lettere cercano, dove possibile, di ricordare i nomi delle srtutture descritte nel file. Un file di PDB e` diviso in due parti: 1) Descrizione della molecola contenuta, dettagli sperimentali della risoluzione della sua struttura, sequenza primaria, referenze. 2) Coordinate atomiche.

5 all`inizio della riga e` sempre riportata la parola ATOM, segue un numero progressivo dell`atomo descritto, i nomi degli atomi descritti, nome dei residui e la posizione nella proteina. Nelle tre sucessive colonne sono riportati i valori delle coordinate cartesiane in angstrom misurate da un`origine arbitraria. PDB non puo` essere considerata una banca dati di files omogenea. A volte i dati contenuti nelle coordinate non corrispondono alle sequenze riportate nella prima parte del file, e la numerazione dei monomeri non riene conto di queste discrepanze. Il motore di ricerca di PDB non e` molto flessibile.

6 MMDB (Molecula Modeling DataBase): presso NCBI, contiene strutture proteiche ricavate da PDB e le archivia con un diverso formato. Diverse procedure di validazione, definizione uniforme delle strutture secondarie, sequenza della catena derivata dalle coordinate, lista di proteine a sequenza e struttura simili alla proteina considerata. DSSP (Dictionary Of Protein Secondary Structure): informazioni su strutture secondarie per ogni entry di PDB. HSSP (Homology derived Secondary Structure of Proteins): informazioni per costruire modelli di proteine a struttura non nota, ma che abbiano una buona identita` di sequenza (>30%) con proteine a strutture nota. FSSP (Fold classification based on Structure Structure of Proteins): contiene confronti di strutture proteiche. Ogni record contiene l`allineamento con proteine a struttura simile e riporta i residui equivalenti nelle strutture.

7 SCOP (Structural Classification Of Protein): organizza le strutture proteiche in modo gerarchico seguendo criteri evolutivi e di similarita` strutturale. Sulla base di domini, le proteine vengono raggruppate in famiglie -> superfamiglie -> fold -> classi CATH: classificazione strutturale simile a quella di SCOP. I livelli di gerarchia sono Class, Architecture, Topology e Homology superfamilies

8 Allineamenti di strutture tridimensionali L`evoluzione delle proteine avviene in modi che generalmente non viene alterato il folding. Proteine a bassa similarita` di sequenza possono avere una similarita` a livello strutturale che evidenzia una traccia dell`evoluzione divergente avvenuta. Confronto di strutture proteiche utile per mettere in evidenza caratteristiche che possono mantenersi conservate a causa di forti vincoli strutturali e funzionali (anche in seguito ad evoluzione che porta la maggior parte della sequenza a divergere). Differenze riscontrate nei siti attivi o di legame delle strutture tridimensionali per spiegare eventuali differenze funzionali.

9 Le strutture proteiche vengono sovrapposte operando rotazioni e traslazioni di una delle due strutture sull`altra scegliendo una regola di corrispondenza tra coppie di atomi o di residui. Spesso le proteine non sono identiche in quanto possono avere lunghezze diverse, presentare delezioni o inserzioni. Nel`allineamento e` utile considerare le catene dei carboni delle strutture secondarie (inserzioni e delezioni si accumulano nei loops che possono essere eliminati dal confronto.) Diversi metodi di confronto utilizzano l`allineamento delle sequenze per decidere la corrispondenza alla base della sovrapposizione strutturale.

10 Un allineamento strutturale puo` essere valutato in base alla deviazione quadratica media (root mean square deviation, r.m.s.d), che rappresenta la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie dell`allineamento. r.m.s.d=sqrt( N D 2 i/n ) I=1 D: distanza tra le coppie degli atomi appaiati N: numero di coppie considerate Minore e` l` r.m.s.d, migliore sara` l`allineamento strutturale calcolato. Un altro criterio consiste nel calcolare il numero di atomi o residui accoppiati. Massimizzare il numero di atomi accoppiati e minimizzare l`r.m.s.d.

11 Predizione struttura secondaria La formazione di elementi di struttura secondaria (SSE) dipende in gran parte dalla loro stessa composizione aminoacidica, ma anche dal loro contestoo strutturale in cui gli elementi sono immersi, ovvero dalle sottostrutture proteiche con cui i singoli elementi si trovano ad interagire nella struttura terziaria. Conferma di relazioni strutturali o funzionali tra proteine, dove la similarita` di sequenze e` bassa Scelta del migliore allineamento tra due sequenze nel modelling per omologia Predizione di struttura terziaria ottenuta attraverso la sovrapposizione deg;li elementi di struttura secondaria.

12 Circa il 50% dei residui di una proteina si trova in strutturata in alfa-eliche o beta filamenti. La necessita` di avvolgersi in particolari strutture secondarie deriva dal fatto che le proteine devono stabilizzare la loro struttura mediante legami ad idrogeno all`interno del core della proteina. Allineamenti multipli -> regioni conservate

13 I metodi per la predizione della struttura tridimensionale delle proteine possono essere suddivisi in tre categorie principali: il modelling comparativo o per omologia (comparative o homology modelling), il riconoscimento del fold (fold recognition) e la predizione ab initio. Nei metodi ab initio il ripiegamento di una proteina viene simulato con metodi computazionali basati su potenziali che simulano le vere forze di interazione tra gli atomi della proteina ed il solvente.

14 Homology modelling L`idea di base e` che proteine che presentano un buon livello di similarita` di sequenza, in genere mostrano un buon livello di similarita` di struttura. In generale >= 30% di identita` di sequenza -> buona similarita` a livello strutturale 50% di identita` -> 90% dei residui si trovano in posizioni strutturalmente conservate.

15 Identificazione di almeno una proteina con struttura nota con una buona % di identita` con la proteina in esame (>30%) Allineamento della sequenza templato con quella a struttura non nota (passaggio critico) Identificazione dei segmenti della catena principale che ci si aspetta siano strutturalmente conservati (es. Elementi a struttura secondaria, SSE, mediante allineamenti multipli di sequenze simili) -> pre-modello Modello delle regioni variabili (loop) -> passaggio complesso, procedure simili a al folding ab initio. Modello delle catene laterali della proteina a struttura non nota sulle catene laterali della proteina a struttura nota. -> utilizzo di rotameri (possibili conformeri delle catene laterali dei residui)

16 Risoluzione di eventuali problemi strutturali manualmente o effettuando calcoli di minimizzazione dell`energia. Sono disponibili diverse procedure, disponibili anche in rete, che permettono di effettuare questo tipo di operazioni in modo automatico. Es. SIB (Swiss Institute of Bioinformatics) e` disponibile il SWISS-MODEL.

17 Threading Tecnica utilizzata nel caso in cui non esista nessuna proteina a struttura nota disponibile simile alla proteina in esame. Le proteine possono esibire un fold simile anche in assenza di una eleveta` similarita` di sequenza. Il numero di fold presenti in natura e` relativamente limitato (tra le 1000 e le 3000 unita`). Il threading e` l`insieme di tecniche sviluppate per valutare la qualita` dell`allineamento tra una sequenza proteica e un fold. 1D->3D Banca dati di fold derivati da PDB Insieme di potenziali (punteggi) per valutare il fit tra una sequenza ed il fold. Algoritmo di allineamento Metodo di selezione

18 Es. metodo sviluppato da David Eisenberg Ogni fold viene descritto in termini di intorno in ogni posizione del fold stesso: struttura secondaria in tre possibili stati (alfa, beta e coil), accessibilita` al solvente (sepolto, parzialmente esposto, esposto) tipo di residui circostanti (polari, apolari) La struttura tridimensionale viene descritta come una sequenza 1D di simboli (es posizione 1= alfa, esposto, polare) Associazione di punteggi empirici, ricavati da frequenze osservate in database di strutture non ridondanti, a ogni tipo di residuo in base alla preferenza per le varie classi descritte sopra (per la sequenza da modellare). In questo modo e` possibile allineare una sequenza proteica con un fold, confrontando le preferenze di ogni residuo con i dati di struttura.

19 Sequenziamento ed analisi dei genomi E chiara la potenzialità del sequenziamento di interi genomi: il DNA dell organismo viene esaminato nella sua globalità, con la possibilità di identificare regioni codificanti e non codificanti (regolative e strutturali). Viene in questo modo stravolto l approccio della genetica classica (fenotipo/gene). Sono due gli approcci principali utilizzati per il sequenziamento di interi genomi: 1) Sequenziamento shotgun gerarchico, detto anche map-based o clone by clone (yeast, E. coli, C. elegans, Arabidopsis thaliana, il genoma umano dell HGP) 2) Whole genome shotgun sequencing (i genomi batterici, Drosophila melanogaster, il genoma umano della Celera Genomics, recentemente il cane, lo scimpanze, e molti altri)

20 Rappresentazione schematica dei due approcci di sequenziamento

21 Approccio clone by clone: Prevede innanzitutto la frammentazione enzimatica del DNA genomico ed il suo clonaggio in vettori che possono alloggiare grandi inserti (BAC o PAC: kbp). Si costruisce una mappa fisica di questi cloni a grandi inserti, adottando approcci di fingerprinting molto stringenti: BAC analizzati con enzimi di restrizione al fine di produrre mappe di restrizione poi analizzati da programmi informatici che identificano regioni di sovrapposizione. E essenziale che la mappa fisica sia particolarmente accurata in quanto errori a questo livello si possono riflettere nella creazione di cromosomi chimere.

22 Successivamente si identifica il così detto minimal tiling path, cioè un subset di cloni tra loro sovrapposti il meno possibile, in modo da ridurre la ridondanza di sequenziamento (e in definitiva la spesa). Ciascuno dei cloni del minimal tiling path viene sequenziato tramite un approccio shotgun in genere fino ad una copertura pari ad 8-10X. A questa prima fase segue quella di finishing che consente di chiudere gli ultimi gap e risolvere le regioni di ambiguità o bassa qualità di sequenza.

23 L approccio clone by clone prevede una prima fase molto time consuming di generazione della mappa fisica. Inoltre, per ciascun clone BAC deve essere creata una libreria shotgun, ed anche questo passaggio richiede tempo (in HGP del 2000, librerie). Ma, la fase di finishing è molto più semplice, e l approccio in sé consente di affrontare particolari regioni (leggi repeats) in maniera singola.

24 Approccio whole genome shotgun In questo caso l intero genoma viene frammentato, non è prevista la produzione della mappa fisica, ma invece si producono librerie (in genere a lunghezze medie diverse, in uomo da 4, 10 e 50kbp) i cui cloni vengono sequenziati a partire da entrambe le estremità. Produzione massiccia e rapida dei dati, ma una notevole difficoltà nella fase di finishing, principalmente nella risoluzione delle repeat lunghe (ad esempio le duplicazioni segmentali nel genoma umano).

25 Progressione del sequenziamento stesso: Con il procedere del sequenziamento aumenta la ridondanza media che corrisponde a quante volte, mediamente, ogni base è stata coperta: spesso questo valore viene espresso in termini di genome coverage. E abbastanza intuitivo il fatto che all aumentare della copertura del genoma la chiusura delle regioni non ancora sequenziate diventi sempre più improbabile. Applicando l equazione della distribuzione di Poisson è possibile stabilire la probabilità P 0 che una base qualunque del genoma non sia già stata sequenziata, in funzione della ridondanza media R: P 0 = e -R

26 Quindi la percentuale di copertura effettiva (%Cop) risulterà essere pari a: %Cop = 100 * (1-e -R ) Da questa formula possono quindi essere calcolati i valori sottostanti In realtà, la copertura effettiva non segue esattamente i valori appena osservati in quanto: esistono delle regioni inclonabili; esistono delle regioni tossiche. Per questo motivo queste regioni non sono presenti nella libreria in sequenziamento e si passa alla fase di finishing.

27 Ma, come passare dalle singole sequenze, alla sequenza dell intero genoma? Esistono dei programmi di assemblaggio (Phrap, Arachne, Celera Assembler, GAP) che sono stati sviluppati per gestire e sovrapporre tra loro le sequenze, in modo da identificare stretch di sequenza identici e quindi generare lunghe sequenze consenso. Phrap nasce per assemblare le sequenze di sottolibrerie BAC, e, nel calcolo della sovrapposizione tra le sequenze, utilizza l algoritmo di Smith e Waterman.

28 Arachne, ma anche Celera Assembler, nascono come programmi per l assemblaggio di interi genomi (ed infatti sono stati utilizzati per assemblare il genoma di topo, o le 27 milioni di sequenze del genoma prodotto dalla Celera). A differenza di Phrap, valutano in maniera particolare dapprima la consistenza dell assemblaggio, controllando il corretto orientamento e distanza dei paired-pairs Successivamente, assemblano considerando anche l apporto delle sequenze non-paired: si genera un assemblaggio accurato ma anche consistente.

29 Come analizzare il risultato di un assemblaggio di sequenze? Esistono dei programmi che consentono di visualizzare l assemblaggio, e in questomodo permettono un più facile svolgimento della fase di finishing. Consed, interfaccia grafica per l analisi dell assemblaggio. In questo caso è rappresentata la Consed main window

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31 La fase di finishing ha lo scopo di ottenere la sequenza finale, prevede una serie di esperimenti utili a: > chiudere i gap > assicurare una alta qualità a tutte le regioni > risolvere le regioni di ambiguità (le repeat)

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33 La sequenza del genoma di un organismo rappresenta una risorsa di informazione incredibile, ma l`informazione e` tanto piu` buona quanto e` buona la sua annotazione. Un nuovo genoma eucariote e` stato completato, e abbiamo a disposizione un file in formato FASTA con 3 miliardi di basi... E ADESSO?

34 Mapping: identificazione dei marcatori, ovverosia posizionare nel genoma tutti i geni, marcatori genetici o altri marcatori precedentemente identificati mediante studi genetici, citogenetici... Quato permette di connettere la letteratura pregenomica con la ricerca post-genomica. Identificazione dei geni: GENESCAN, Genie, GeneMark.hmm, Grail, HEXON, MZEF, Fgenes, HMMGene. Identificano i geni riconoscendo particolari motivi e caratteristiche o mediante propieta` statistiche del DNA (geni assiciati con regioni ricche in G+C). Predione genica risulta essere lontana dalla perfezione. Sensitivita` (identificare veri positivi) del 40% e specificita` (discriminare falsi positivi) 30% nell`identificare i inizio e fine di un esone => esoni incorretti o mancanti Alternativa: un match nucleotidico ad un cdna ad esempio rappresenta una buona evidenza che in quella regione c`e` un gene.

35 Pseudogeni EST possono soffrire di artefatti (contenere ad esempio DNA genomico, chimere o errori di sequenziamento). CDNA possono contenere elementi ripetuti similarita` con proteine di altri organismi possono essere evolutivamente divergenti. Splicing alternativi che complicano l`allineamento. Database non sono completi! Tendenza ad affiancare a programmi di predizione il maggior numero di dati derivati da similarita` di sequenza.

36 RNA non codificanti e regioni regolatorie. La maggior parte del DNA e` non codificante. trna, small nuclear RNAs, rrna (identificati per omologia) Trascriptional-factor-binding site -> TRANSFAC o PROSITE, tradizionalmente identificati mediante metodi sperimentali. MEME program-> programma di predizione che identifica motivi che compaiono piu` spesso di quanto predetto per caso. Elementi Ripetuti

37 Annotazione dei geni al fine di assegnare un nome e una funzione putativa ai geni. Di questo set, solo una piccola frazione corrisponde a proteine note e ben caratterizzate. Conviene quindi raggruppare le proteine in famiglie e usare similarita` con con proteine di altre specie. Similarita` di sequenza non implinca similarita` di funzione. Paraloghi!= ortologhi COG= Cluster of Orthologous Genes Annotazione mediante blast e psi-blast in SWISS-PROT, TrEMBL, ricerca di motivi in PFAM (HMM), PROSITE, SMART (collezione di domini proteici), BLOCKS (blocchi di regioni conservate di proteine e allineamenti multipli. ) InterPro: sistema di cross-referencing, unifica tutti i database descritti sopra.

38 Genomica Funzionale L`ultima e, per molti versi, la vera sfida nell`annotazione di un genoma e` mettere in relazione il genoma ai processi biologici. In che modo i geni e le proteine sono relazionate al ciclo cellulare, alla morte cellulare, all`embriogenesi, al metabolismo...? Il grosso problema consiste nella mancanza di uno schema che metta in relazione l`annotazione di una funzione biologica attraverso le diverse specie con la specificita` di di distinguere una particolare proteina da altri membri della sua famiglia. Gene Ontology, GO (Saccharomyces Genome Database, FlyBase Mouse Genome Database). GO e` un vocabolario standard per descrivere la funzione di un gene. Consiste in tre sottoparti : Molecular function= descrive la funzione di una proteine, come ad esempio un`attivita` enzimatica. Biological process= descrive il processo in cui e` implicato il gene, ad esempio meiosi.

39 Cellular component: descrivono le proteine in termini di strutture subcellulari nelle quali sono localizzate, come organelli o macrimolecole (es ribosomi). La Gene Ontology organizza i termini in una gerarchia (directed acyclic graph che consentono ad un termine di comparire piu` volte. Ogni termine puo` avere piu` di un padre). Ad esempio il termine generico enzyme porta ad termini piu` specifici come lyase o carbon-oxygen lyase... La flessibilita` consiste nell`annotare qualsiasi gene ad al livello di specificita` che l`attuale conoscenza biologica permette.