Principali vie di utilizzo del Glucosio

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1 Principali vie di utilizzo del Glucosio

2 DESTINO DEL PIRUVATO Il piruvato, può seguire due vie. La via fermentativa La via della respirazione cellulare In presenza di ossigeno, il piruvato, viene ossidato completamente a CO 2 e H 2 O, attraverso il processo di respirazione cellulare Fermentazione Etanolo/ Ac. Lattico

3 Respirazione cellulare Fase 1 1) Catabolismo di acidi grassi 2) Glucosio 3) Amminoacidi Fase2 Ciclo dell acido citrico: ossidazione dell acetil CoA con produzione di NADH,FADH 2, GTP Fase 3 Trasferimento di elettroni dal NADH efadh2 ai trasportatori di elettroni con riduzione dell O 2 Fosforilazione ossidativa che consente di produrre ATP

4 Fasi della respirazione cellulare La respirazione cellulare ha luogo in 3 fasi: - prima fase : il piruvato forma un composto a 2 atomi di carbonio, ossia il gruppo acetilico inserito nell Acetil-CoA. -seconda fase : tali gruppi acetilici entrano nel ciclo dell acido citrico che provvede a ossidarli per via enzimatica a CO 2. In questo processo, l energia rilasciata dall ossidazione viene conservata mediante la riduzione contemporanea di due trasportatori di elettroni NAD + e FAD, che divengono NADH e FADH 2. -terza fase : i cofattori ridotti sono ossidati a loro volta liberando protoni H + ed elettroni. Gli elettroni vengono trasferiti attraverso trasportatori che compongono la catena respiratoria, sino all ossigeno che si riduce formando acqua. Durante questo processo viene rilasciata una notevole quantità di energia, tramutata in ATP per mezzo della cosiddetta fosforilazione ossidativa

5 Decarbossilazione del piruvato e Formazione di acetil-coa Il piruvato, derivato dalla glicolisi, viene ossidato nei mitocondri ad opera di tre enzimi che compongono il complesso della piruvato deidrogenasi che catalizza una reazione di decarbossilazione ossidativa : il gruppo carbossilico del piruvato viene rilasciato come CO 2. I due atomi di carbonio rimanenti costituiscono il gruppo acetilico legato al coenzima A PROCESSO IRREVERSIBILE

6 Fase I: formazione di acetil-coa catalizzatore: complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi TRE enzimi + CINQUE coenzimi Localizzazione: nei mitocondri delle cellule eucariotiche nel citosol delle cellule procariotiche E1 = piruvato deidrogenasi (piruvato decarbossilasi) - TPP E2 = diidrolipoil transacetilasi acido lipoico E3 = diidrolipoil deidrogenasi FAD + NAD +, CoASH (il complesso multienzimatico contiene più copie dei tre enzimi) Fanno parte del complesso anche due proteine regolatrici: una chinasi e una fosfatasi

7 Complesso della piruvato deidrogenasi (da E.coli) Regione centrale formata da 24 molecole di E2 Circondata da 24 molecole di E1 e da12 molecole di E3

8 Complesso PDH isolato da rene bovino. 60 copie di E2 E2 con più domini lipoilici

9 E2 presenta tre domini funzionali distinti

10 TPP = coenzima di E1: piruvato deidrogenasi (piruvato decarbossilasi) La Tiamina pirofosfato (TPP) derivato della tiamina (Vitamina B1) R 2 R 1 -

11 E2: diidrolipoil transacetilasi Coenzima = acido lipoico (lipoato)

12 COENZIMA A: accettore del gruppo acetile CoA-SH

13 E3: diidrolipoil deidrogenasi Coenzima: FAD = Flavin Adenin Dinucleotide (idrochinone)

14 E3: diidrolipoil deidrogenasi Coenzima: NAD = Nicotiammide Adenin Dinucleotide

15 E1: decarbossilazione del piruvato e formazione di idrossietil-tpp CO 2 idrossietil-tpp

16 Fermentazione alcolica Piruvato Piruvato decarbossilasi Attacco nucleofilo del carbanione della TPP sul carbonio carbonilico del piruvato Acetaldeide ADH Etanolo Protonazione del carbanione Rilascio di CO2 Formazione di un carbanione stabilizzato per risonanza

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18 E1: trasferimento del gruppo acetile e di elettroni al lipoato idrossietil-tpp CoA-SH E2: transesterificazione in cui il gruppo SH del CoA si sostituisce al gruppo -SH di E2.

19 E3 diidrolipolil deidrogenasi: riossidazione del lipoato FAD FADH2 NADH + H + NAD +

20 Sito attivo della diidrolipoil deidrogenasi D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA 2/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2007

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22 Incanalamento dei substrati Mutazioni nella PDH o carenza di Tiamina nella dieta sono causa di alterazioni della funzionalità neuronale (Beriberi)

23 Regolazione della piruvato deidrogenasi 1. Regolazione allosterica: Attivatori: NAD+ CoA-SH AMP Inibitori: NADH acetil-coa ATP 2. Regolazione da modificazione covalente: inattivazione mediante specifica chinasi che fosforila E1 (la piruvato deidrogenasi chinasi è attivata da NADH e acetil-coa) attivazione medante fosfatasi che defosforila l enzima

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29 CICLO DEGLI ACIDI TRICARBOSSILICI

30 Reazione :condensazione Formazione del citrato : l acetil-coa viene condensato con l ossalacetato per formare citrato, reazione catalizzata dalla citrato sintasi. Nella reazione il C del gruppo acetilico si lega al C-2 dell ossalacetato. La grande variazione di energia libera è essenziale per l operatività del ciclo. La citrato sintasi è attivata allostericamente da Ca 2+ ed ADP ed è inibita da ATP NADH, succinilcoa e acilcoa derivanti dagli acidi grassi. La reazione dipende inoltre dalla disponibilità dei substrati

31 Modificazioni conformazionali della citrato sintasi Forma aperta Forma chiusa che lega l ossalacetato Ognuna delle due subunità dell enzima omodimerico è costituita da due domini; L ossalacetato legandosi induce un cambiamento conformazionale nel dominio flessibile creando un secondo sito attivo per l acetil CoA. Quando nel sito attivo si forma il citroil CoA un altra modifica conformazionale determina l idrolisi del tioestere con il rilascio di CoA

32 Il legame tioestere attiva gli idrogeni metilici Asp375 estrae un protone dal gruppo metilico L enolato si riarrangia per attaccare il carbonio carbonilico dell ossalacetato His 274 estrae un protone precedentemente ceduto His320 si comporta da acido cedendo un protone Viene idrolizzato il legame tioestere Si libera citrato e CoA

33 Reazione :isomerizzazione Formazione dell isocitrato :reazione di isomerizzazione del citrato, per mezzo dell enzima aconitasi. L enzima è inibito da fluoroacetato, usato come veleno ratticida

34 Il Centro ferro zolfo dell aconitasi agisce sia nel legame del substrato nel sito attivo sia nell aggiunta o rimozione catalitica dell acqua

35 Reazione :ossidazione e decarbossilazione Ossidazione dell isocitrato : per mezzo dell isocitrato deidrogenasi che opera una decarbossilazione ossidativa convertendolo ad α-chetoglutarato e CO2. Enzima attivato allostericamente da ADP, che indica un basso livello energetico E inibito da ATP e NADH i cui livelli sono elevati quando la cellula ha riserve energetiche abbondanti Isocitrato deidrogenasi NAD-dipendente = mitocondri Isocitrato deidrogenasi NADP-dipendente= citoplasma

36 Reazione :ossidazione e decarbossilazione Inibitori: succinil-coa, ATP, GTP, NADH L α-chetoglutarato viene convertito a succinil-coa e CO 2 mediante decarbossilazione ossidativa per mezzo dell α-chetoglutarato deidrogenasi, in questa tappa il NAD+ è l accettore finale degli elettroni.

37 Reazione :fosforilazione a livello di substrato Succinil-CoA sintetasi o succinato tiochinasi Scissione del succinil CoA a succinato : Il GTP prodotto da questa reazione nel mitocondrio è prevalentemente usato dall'enzima mitocondriale nucleoside difosfo chinasi per una reazione di transfosforilazione in cui viene prodotto ATP a partire da ADP: Il GDP necessario per la reazione della succinil-coa sintetasi viene così rigenerato Mg 2+ GTP + ADP GDP + ATP nucleoside difosfato chinasi

38 fosforilazione a livello di substrato

39 GDP GTP

40 Reazione :ossidazione * *enzima associato alla membrana mitocondriale interna Ossidazione del succinato a fumarato:. Gli elettroni dal succinato passano al FAD riducendolo. Il FADH 2 cede gli equivalenti riducenti alla catena di trasporto degli elettroni della membrana interna del mitocondrio.

41 Reazione :idratazione Idratazione del fumarato: di natura reversibile, catalizzata dalla fumarasi che converte i fumarato in malato;

42 Reazione :ossidazione Ossidazione del malato : l ultima reazione del ciclo consente di ossidare il malato in ossalacetato mediante L-malato deidrogenasi (NAD dipendente)

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44 REGOLAZIONE DEL CICLO DI KREBS - Disponibilità di substrato - Inibizione da accumulo di prodotti - Inibizione allosterica retroattiva regolazione dei primi enzimi del ciclo da parte di prodotti di reazioni successive

45 7,5 1,5 10 Acetil-CoA + 3 NAD + + FAD + GDP + P i + 2 H 2 O 2 CO NADH + FADH 2 + CoA-SH + GTP + 3 H+

46 Formazione di coenzimi ridotti e di ATP nell ossidazione aerobica del glucosio

47 Stechiometria della riduzione dei coenzimi e della formazione di ATP nell ossidazione aerobica del glucosio attraverso le tre fasi della respirazione cellulare NADH/FADH 2 ATP Glucosio Glucosio 6P -1ATP Fruttosio 6P Fruttosio 1,6 Bifosfato -1ATP Glicolisi 2 Gliceraldeide 3 P 2 1,3 Bifosfoglicerato 2NADH 3/5 2 1,3 Bifosfoglicerato 2 3Fosfoglicerato 2ATP 2 Fosfoenol piruvato 2 Piruvato 2ATP 2 Piruvato 2 Aceti-CoA 2NADH 5 Ciclo di Krebs 2 Isocitrato 2 chetoglutarato 2NADH 5 2 chetoglutarato 2 succinil CoA 2NADH 5 2 succinil CoA 2 succinato 2ATP/GTP 2 succinato 2 fumarato 2FADH malato 2 ossalacetato 2NADH 5 TOTALE

48 Regolazione del flusso di metaboliti nel ciclo di Krebs da parte della piruvato deidrogenasi e degli enzimi coinvoti nel ciclo di Krebs

49 Nei batteri anaerobici il ciclo dell acido citrico è incompleto perché manca la -chetoglutarato deidrogenasi

50 Il ciclo di Krebs è una via anfibolica: - riceve intermedi del catabolismo di carboidrati, acidi grassi, amminoacidi

51 è anche fonte di precursori per molte vie biosintetiche In rosso le reazioni anaplerotiche che riforniscono il ciclo degli intermedi sottratti

52 Prelevano intermedi del ciclo TCA per le vie biosintetiche Biosintesi del glucosio (Gluconeogenesi) L ossalacetato prodotto nei mitocondri è trasformato in malato che è trasportato attraverso la membrana mitocondriale e poi ritrasformato in ossalacetato e convertito in PEP

53 Biosintesi degli acidi grassi Processo che avviene nel citosol che richiede Acetil-CoA che non può essere trasportato attraverso i mitocondri, pertanto è prodotto nel citosol. L acetil-coa citosolico è prodotto dalla scissione del citrato, che può attraversare al membrana mitocondriale. ATP + citrato+ CoA ATP citrato liasi ADP+ Pi + ossalacetato+ Acetil-CoA

54 Biosintesi degli amminoacidi COO - CH2 + NADH+ H + + NH 4 CH2 H C NH 3 + COO -

55 Riforniscono il ciclo di Krebs di intermedi Piruvato carbossilasi + HCO 3- + ATP ossalacetato + ADP + P i - attivazione da acetil-coa il coenzima della piruvato carbossilasi è la BIOTINA

56 RUOLO DELLA BIOTINA NELLA REAZIONE CATALIZZATA DALLA PIRUVATO CARBOSSILASI HCO Piruvato + ATP Ossalacetato+ ADP+ Pi IL BRACCIO DELLA BIOTINA LEGATO ALLA LYS DELLA PIRUVATO CARBOSSILASI (ENZIMA TETRAMERICO) SPOSTA LA CO 2 TRASFERENDOLA DAL SITO ATTIVO DI UN MONOMERO A QUELLO DEL MONOMERO ADIACENTE

57 Meccanismo d azione della piruvato carbossilasi e ruolo della biotina nella carbossilazione del piruvato in ossalacetato

58 Bracci biologici

59 CICLO DEL GLIOSSILATO Il ciclo del gliossilato è presente nelle piante in alcuni invertebrati e nei microrganismi e produce intermedi a 4 atomi di carbonio a partire da acetato Il succinato prodotto può essere convertito in ossalacetato, che puòessereusatopersintetizzare glucosio attraverso la gluconeogenesi.

60 Relazione tra il ciclo del gliossilato e quello dell acido citrico Il ciclo del gliossilato è attivo durante la germinazione dei semi di alcune piante e in certi microrganismi che possono vivere usando acetato come unica fonte di carbonio.

61 Regolazione coordinata del ciclo del gliossilato e dell acido citrico Se c è un ridotto rifornimento energetico La fosfatasi viene attivata, defosforila l isocitrato deidrogenasi attivandola, favorendo il ciclo dell acido citrico